重离子诱变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究

发布时间：2020-02-04 18:34

【摘要】：酵母β-葡聚糖作为酵母细胞壁的主要成分,是一种重要的功能性多糖,它不仅具有增强机体免疫功能、抗炎症、抗肿瘤等多重功效,被广泛应用于医药行业及肿瘤的治疗中,还可作为保水剂、膳食纤维等功能因子用于食品生产行业中。酵母作为重要的β-葡聚糖来源,如何提高酵母细胞壁β-葡聚糖的含量,以获得高产量的β-葡聚糖酵母菌种,是本文研究的重点。本研究利用12C6+离子束辐照处理面包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),选育出高产β-葡聚糖的优良面包酵母菌株100G-9,同时通过建立高通量的酵母β-葡聚糖筛选检测方法,便于更高效地筛选突变株;通过优化诱变面包酵母菌株100G-9的培养条件及细胞壁内酵母β-葡聚糖的提取工艺,达到提高诱变酵母菌株100G-9的生物积累量及β-葡聚糖得率的目的。本研究为重离子诱变选育优良面包酵母菌株提供科学依据,并为今后酵母β-葡聚糖的工业化生产奠定了理论和实验基础。1.重离子辐照选育高产β-葡聚糖酵母菌株实验对原始酵母菌株(CK)经过不同剂量的12C6+离子束辐照诱变,统计得到酵母细胞的存活率。结果表明酵母菌株的半致死剂量约为100Gy,且在该辐照剂量下有利于突变酵母菌株的筛选;利用苯酚-硫酸法对酵母β-葡聚糖的含量进行测定,采用96孔板与酶标仪结合的方法代替紫外分光光度计法,建立了高通量、快速的微量检测方法,提高了酵母突变菌株的筛选效率。经过优化后的检测样品单孔进样量为200ul,单次进样数为96个,且检测精密度良好,当样品浓度的范围在0.001-0.25mg/ml区间内时,相关系数R20.99。筛选得到了5株高产β-葡聚糖酵母菌100G-1、100G-9、80G-25、140G-7以及100G-2,经过连续9代的斜面传代培养后,遗传稳定性良好。2.高产β-葡聚糖面包酵母菌生长条件的优化研究实验优化了高产诱变酵母菌株100G-9的培养基,包括:碳源、氮源及无机盐,并得到该菌株最适培养基配比:甜高粱汁4.0%,蛋白胨0.5%,牛肉膏1.0%,酵母抽提物0.5%,K+离子0.1%,Mg2+离子0.1%。在此条件下,100G-9酵母菌株的生物量积累可达到8.16g/L,比未经优化的对照组高出5.8%。实验表明,通过优化培养基配比,可以有效提高酵母的生物量积累。3.酵母β-葡聚糖提取条件的正交优化为了获得100G-9酵母菌株的β-葡聚糖最佳提取条件,将提取过程中涉及的三个重要因素进行了正交优化,三种不同的提取因素对β-葡聚糖得率的影响程度分别为:NaOH浓度提取温度提取时间,最佳的提取条件为:NaOH浓度2.0mol/L,提取温度90℃,提取时间2.5h。正交优化后的酵母β-葡聚糖得率可达到12.51%,β-葡聚糖的纯度可达到95.21%,与原始的提取条件相比β-葡聚糖得率提高了3.23%,β-葡聚糖的纯度与以往文献所报道的90.6%的纯度含量相比提高了4.61%。
【图文】：

变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究 或β-(1,4)糖苷键协同链接结合而成的多聚物，，而酵母等其他微生糖则是通过β-(1,3)糖苷键或β-(1,6)糖苷键分支的协同连接构成的特征被命名为β型葡聚糖[16]。其组成结构中，不同类型的β-葡同的空间结构及分子量，其功能作用也不尽相同。例如，以β-葡多糖[17]和裂裥菌素多糖[18]经常在癌症治疗中作为辅助剂被使用胞壁中分离出来的β-葡聚糖则多应用于食品行业的增稠剂[19]。还量的β-葡聚糖，如硬葡聚糖、褐藻淀粉、茯苓聚糖、灰树花多聚定的应用价值等待发掘[20]。Β-葡聚糖不但具有良好的生物活性，高持水力等性能特点，所以现在针对β-葡聚糖的研究已成为热点

酿酒酵母细胞壁中的葡聚糖总共分为三种，分别为碱不溶性葡性葡聚糖及酸溶性葡聚糖，共同占据细胞壁干重的 30-60%[23,24]，分别胞壁中所比例约为 17：10：3，其中以β-(1,6)糖苷键连接的葡聚糖即为研究关注的碱不溶性β-葡聚糖[25]，约占据酵母细胞壁干重的 20-50%。中叶，人类首次从面包酵母的细胞壁中成功提取获得了β-葡聚糖，并发较强的免疫活性[26]，而酵母中剩余的主要成分脂质（10-15%左右），15-25%左右）以及甘露聚糖（20%左右）也一一得到分析确定[27]。.2 酿酒酵母细胞壁的结构酿酒酵母作为与人类生活息息相关的一类真核微生物，它的细胞壁中所成分为β-葡萄糖（β-Glucan）。二十世纪初，Manners 等[28]人通过研究母细胞壁中存在着两种不同类型的β-葡聚糖，其中占据了细胞壁β-葡聚 85%的主要为β-1,3-葡聚糖（含有 3%的β-1,6 糖苷支链），是细胞壁中成分，而含有β-1,3 糖苷支链的β-1,6 葡聚糖则仅仅占据了 15%。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93

【参考文献】

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本文编号：2576393