细菌Erythrobacter longus来源酯酶E53的表达、酶学性质及其结构的研究

发布时间：2020-03-09 08:11

【摘要】：酯酶普遍存在于动植物和微生物中,能够催化酯键水解,并参与酯化、转酯、酯交换等多种反应。微生物来源的酯酶作为一类重要的工业酶制剂,由于其反应条件稳定、催化活性高和产物易分离等优点,广泛应用于食品加工、医药化工生产、污水净化和能源利用等领域,成为目前应用酶学方面研究的热点。本论文主要针对一个筛选自赤杆菌科细菌基因组的酯酶,开展诱导表达、分离纯化、酶学性质和晶体结构解析研究,为进一步研究酯酶的催化机制和结构与功能关系提供理论支持。本文研究中,首先针对筛选自赤杆菌科细菌Erythrobacter longus基因组的酯酶E53开展诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究。结果表明酯酶E53分子量大小为33.13 kDa,最适催化底物为对硝基苯酚丁酸酯,最适反应条件为pH 9.0,温度40°C。酯酶E53对于金属离子Mn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Ba~(2+)以及异丙醇、乙醇、甲醇等有机溶剂具有良好的耐受性,具有潜在的应用前景。其次,通过表达纯化获得酯酶E53蛋白,并针对蛋白结晶条件开展优化,最终筛选获得形状规则、晶型较好的单晶。收集晶体X射线衍射数据,并对晶体结构进行解析和修正,获得酯酶E53接近完整的三维结构,为进一步研究酯酶E53的催化机制奠定了基础。最后,通过定点突变构建了酯酶E53的12个突变体,并对酯酶突变体开展酶学性质研究。结果表明,酯酶突变体E53-D161A、E53-S285G和E53-N288A的酶活力和催化反应速率是野生型酯酶的1%-20%左右,以上三个位点的氨基酸在酯酶的催化反应发挥重要作用;酯酶突变体E53-A167L、E53-F191Y、E53-V211A和E53-S216A酶活力和催化反应速率与野生型酯酶相比增加了50%以上,表明以上四个位点氨基酸对酯酶催化反应有一定的影响;催化活性位点的酯酶突变体E53-S162A、E53-D254A和E53-H284A酶活力只有野生型的万分之一左右,表明活性位点对于酯酶的催化反应发挥着关键作用。综上所述,通过对酯酶E53酶学性质的研究,结果表明其具有潜在的应用价值;对酯酶E53的晶体结构解析为进一步研究酯酶的催化机制和结构与功能关系奠定了良好的基础;酯酶E53突变体构建及其酶学性质的研究,为探索与酯酶的催化反应发挥重要作用的氨基酸残基和进一步构建适合工业应用的工程酶奠定了理论基础。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55

【参考文献】