重组琼胶酶AgaD的高效表达及初步研究

发布时间：2017-03-26 22:06

  本文关键词：重组琼胶酶AgaD的高效表达及初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：琼胶来源于紫菜、石花菜等红藻细胞壁,主要成分为硫琼胶和琼脂糖,琼脂糖由β-D-呋喃半乳糖和3.6-内醚-α-L-呋喃半乳糖通过β-1,4-糖苷键和α-1,3-糖苷键交替连接而成。琼胶酶是降解琼脂糖产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶,根据其降解琼脂糖的方式可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。目前已经报道的琼胶酶多为β-琼胶酶,分属于糖苷水解酶GH-16、50、86和118家族,而α-琼胶酶数量非常少,仅有4个,均属于GH-96家族。β-琼胶酶降解琼脂糖的β-1,4糖苷键产生新琼寡糖,α-琼胶降解α-1,3糖苷键产生琼寡糖。琼胶寡糖属于中性糖,具有多种生物学活性,是一种潜在的益生元寡糖。课题组前期从青岛海域分离得到一株产琼胶酶的菌株Thalassomonas sp.LD5,通过构建野生菌株的基因组文库结合兼并PCR和site-finding PCR的方法获得了琼胶酶编码基因agaD,其开放阅读框长4401bp,编码1466个氨基酸。序列分析表明,AgaD与GH-96家族已有文献报道的两个α-琼胶酶成员的氨基酸序列相似性分别达到了77%和89%。对AgaD野生酶和初步表达的重组酶研究发现其产量均非常低(重组酶仅有20U/L),因此提高重组酶AgaD的产量对后续研究非常必要。本研究首先探讨了密码子适用性对agaD重组表达的影响,通过基因合成的方法合成了优化后的基因optagaD;选择了三种不同的E.coli表达宿主,结果表明,目的基因在AD494(DE3)宿主中表达的酶活最高,达到450U/L发酵液,表明二硫键的形成可能对酶的正确折叠具有重要的作用；根据N端法则,研究了N端第二个氨基酸替换后对重组酶的影响,结果表明将苯丙氨酸(Phe)替换为丙氨酸(Ala)后,胞外酶产量提高了近5倍,并且重组酶的发酵时间缩短了一半；最后,探究了不同的发酵条件及培养基添加成分对产酶量的影响,确定了500 mL瓶中的最适装样量为50 mL,最适诱导剂浓度为0.0004mol/L,诱导温度为25℃,添加CaC12至浓度0.005-0.02 mol/L、甘氨酸(Gly)至浓度0.1mol/L均可以明显提高胞外酶的产量。最终经过表达宿主、N端法则、发酵条件、培养基等优化,发酵液上清中重组琼胶酶AgaD的产量由20U/L提高到了11300 U/L,提高了近500倍,为琼胶酶AgaD的深入研究奠定了基础。接下来我们探讨了重组酶的分离纯化条件,重组酶可以被60%饱和度的硫酸铵沉淀,但是硫酸铵对酶活有明显的抑制作用,不利于后期的分离纯化检测,NaCl替代实验发现尽管菌株LD5分离自海洋细菌,但是重组琼胶酶AgaD表现出非常强的NaCl抑制性,当浓度达到2mol/L时,活力下降了一半以上。相反,CaCl2可以明显促进酶的活力,在0.05 mol/L CaCl2存在时即使NaCl浓度达到4mol/L酶活力仍然可以维持稳定在原来的90%以上；构建了携带Flag标签的重组蛋白,分别利用His标签抗体及Flag标签抗体对纯化的蛋白进行了Western-blot检测,结果表明两种抗体检测均出现多个条带,该结果与凝胶原位复性方法检测结果一致,进一步表明目的蛋白发生了不同程度的剪切或断裂,导致纯化的蛋白在SDS-PAGE上呈现出不同大小的片段。利用纯化后的重组蛋白研究了AgaD降解琼脂糖的终产物,薄层层析及荧光辅助电泳显示终产物的迁移率与琼三糖相似；使用用不同聚合度的新琼寡糖作为底物分析了AgaD的催化腔特征,结果表明AgaD不能降解新琼二糖和四糖,对新琼六糖仅能部分降解,而新琼八糖和十糖可以完全降解,因此我们认为该酶的催化腔最小可以容纳六个糖单元；AgaD降解琼脂糖的降解曲线表明,该酶降解琼脂糖的方式为内切。在后续研究中我们将进一步对重组蛋白AgaD的剪切或断裂机制进行研究。此外,我们在分离纯化重组酶中发现选用的几种宿主菌均能够表达β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶,而这些酶在分离纯化过程中不容易去除,导致AgaD的降解产物可能进一步发生降解,因此无法利用产物的还原端正确判定AgaD的属性,因此我们将通过更换宿主菌或者基因敲除的方式,以及其他的分离纯化手段获得不含有半乳糖苷酶的重组蛋白,并利用核磁、质谱等方法研究AgaD产物的属性。
【关键词】：琼胶酶 重组表达 分离纯化 降解方式
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q55
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 0 前言15-28
• 0.1 琼胶(agar)及琼寡糖15-16
• 0.2 琼胶酶16-25
• 0.2.1 琼胶酶分类16-18
• 0.2.2 琼胶酶来源及性质18-20
• 0.2.3 琼胶酶的基因克隆及重组表达20-22
• 0.2.4 琼胶酶的晶体结构研究22-24
• 0.2.5 琼胶酶的应用24-25
• 0.3 前期工作及展望25-28
• 1 agaD序列密码子优化及不同表达宿主的表达28-41
• 1.1 实验材料与仪器28-29
• 1.1.1 实验仪器28-29
• 1.1.2 实验试剂和材料29
• 1.2 实验方法29-33
• 1.2.1 agaD序列分析及密码子优化29-30
• 1.2.2 优化后目的基因的获得30-31
• 1.2.3 制备pET-22b(+)载体31
• 1.2.4 构建重组表达体系31-32
• 1.2.5 optagaD基因的诱导表达32
• 1.2.6 酶活的测定32-33
• 1.2.7 常规最适表达条件的确定33
• 1.3 实验结果33-39
• 1.3.1 优化目的基因33-34
• 1.3.2 获得优化后的目的片段optagaD34
• 1.3.3 pET-22b(+)载体制备34-35
• 1.3.4 连接后的酶切鉴定35
• 1.3.5 DNS法测定酶活所使用的D-半乳糖标准曲线35-36
• 1.3.6 转化不同宿主发酵上清的酶活力测定36-37
• 1.3.7 最适表达条件的确定37-39
• 1.4 小结及讨论39-41
• 2 N端第2个氨基酸突变体构建41-49
• 2.1 实验仪器与材料41-42
• 2.1.1 实验仪器41-42
• 2.1.2 实验试剂和材料42
• 2.2 实验方法42-46
• 2.2.1 将目的基因N端突变42-44
• 2.2.2 制备pET-22b(+)载体44-45
• 2.2.3 建立重组表达系统45
• 2.2.4 optagaDx基因的表达45-46
• 2.3 实验结果46-47
• 2.3.1 突变后基因的获取46
• 2.3.2 制备pET-22b(+)载体46
• 2.3.4 酶切鉴定连接后产物46-47
• 2.3.5 突变前后产酶情况比较47
• 2.4 小结及讨论47-49
• 3 摇瓶培养初步优化49-56
• 3.1 实验仪器与材料49-50
• 3.1.1 实验仪器49
• 3.1.2 实验材料49-50
• 3.2 实验方法50-51
• 3.2.1 种子培养液的培养50
• 3.2.2 不同的装样量50
• 3.2.3 在培养基中添加不同碳源或消泡剂50
• 3.2.4 在培养基中添加CaCl_250
• 3.2.5 在培养基中添加Gly50-51
• 3.2.6 常规最适表达条件的确定51
• 3.2.7 酶活测定方法51
• 3.3 实验结果51-54
• 3.3.1 不同装样量对酶活的影响51
• 3.3.2 在培养基中添加不同碳源或消泡剂51-52
• 3.3.3 在培养基中添加CaCl_252-53
• 3.3.4 在培养基中添加Gly53-54
• 3.3.5 常规最适表达条件的确定54
• 3.4 小结及讨论54-56
• 4 重组琼胶酶AgaD的纯化及检测56-75
• 4.1 实验仪器与材料56-57
• 4.1.1 实验仪器56-57
• 4.1.2 实验试剂57
• 4.2 实验方法57-64
• 4.2.1 AgaD琼胶酶的发酵57
• 4.2.2 NaCl及CaCl_2对酶活的影响57-58
• 4.2.3 硫酸铵沉淀发酵液58-59
• 4.2.4 离子交换层析59
• 4.2.5 镍离子层析59
• 4.2.6 疏水作用层析59-60
• 4.2.7 酶活测定方法60
• 4.2.8 蛋白质浓度及比活力测定60
• 4.2.9 蛋白电泳检测60
• 4.2.10 His抗体检测目的蛋白60-61
• 4.2.11 构建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表达体系61-64
• 4.2.12 optagaDx-Flag基因的表达及Western-blot检测64
• 4.2.13 胶复性检测目的蛋白64
• 4.3 实验结果64-74
• 4.3.1 硫酸铵沉淀64-65
• 4.3.2 NaCl及CaCl_2对酶活的影响65-66
• 4.3.3 离子交换层析66-67
• 4.3.4 镍离子柱层析67-68
• 4.3.5 疏水作用层析68-69
• 4.3.6 蛋白含量的测定69-70
• 4.3.7 蛋白电泳检测70-71
• 4.3.8 His抗体检测目的蛋白71-72
• 4.3.9 构建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表达体系72
• 4.3.10 optagaDx-Flag基因的表达及Western-blot检测72-73
• 4.3.11 胶复性检测目的蛋白73-74
• 4.4 小结及讨论74-75
• 5 AgaD重组琼胶酶初步研究75-85
• 5.1 实验仪器与材料75-76
• 5.1.1 实验仪器75-76
• 5.1.2 实验材料76
• 5.2 实验方法76-78
• 5.2.1 获得琼胶寡糖标准品76
• 5.2.2 获得AgaD降解产物76
• 5.2.3 TLC层析鉴定寡糖76-77
• 5.2.4 AgaD降解不同的寡糖77
• 5.2.5 AgaD不同时间降解产物77
• 5.2.6 荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)检测降解情况77-78
• 5.3 实验结果78-84
• 5.3.1 新琼寡糖的制备及定量结果78-79
• 5.3.2 AgaD降解琼脂糖酶的补加策略79-80
• 5.3.3 AgaD降解琼脂糖的终产物分析80-81
• 5.3.4 AgaD最小底物确定81-82
• 5.3.5 AgaD降解琼脂糖的Time course曲线82-84
• 5.4 小结与讨论84-85
• 总结及展望85-86
• 参考文献86-91
• 附录91-103
• 附录1 培养基、试剂及溶液的配制91-96
• 附录2 常用分子生物学实验方法96-101
• 附录3 缩略词101-103
• 致谢103-104
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果104

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1 刘欢;重组琼胶酶AgaD的高效表达及初步研究[D];中国海洋大学;2015年

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本文编号：269422