斑马鱼补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达

发布时间：2017-03-29 04:16

  本文关键词：斑马鱼补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：补体系统是先天性免疫的重要组成部分。在鱼类中,其胚胎体外受精并发育,水中大量病原体直接接触胚胎。鱼类特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限。且在胚胎发育早期,特异性免疫系统尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。斑马鱼作为发育生物学及免疫学研究的模式生物,其大量补体基因包括三条补体激活通路及溶膜途径的主要因子以及多种补体调节基因已被鉴定,但在表达及功能上的研究较少,其中关于胚胎期这些基因作用的研究更鲜有报道。本文以模式生物斑马鱼为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR技术,对斑马鱼补体基因(C3、C4、C9、Bf1、Bf2、Bf2)及其调节基因(RCA2.1、RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS注射刺激后表达量的变化进行了研究。本文首次通过原位杂交的方式研究了上述几个重要补体基因尤其是Bf2、Bf3两个亚型及RCA2.1、RCA2.2两个补体调节因子在早期胚胎中的表达图式。实验结果显示,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,于受精后24 h主要集中表达在头部,而在孵化后的幼鱼阶段特异性表达在肝脏及消化道等部位,这些组织器官为补体早期表达的主要部位。在斑马鱼成鱼中这些补体基因也主要表达在肝脏及消化道,本实验证明斑马鱼在幼鱼期即形成了这种表达模式。对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、 Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革蓝氏阴性菌感染后补体分子(C3、C9、B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统参与急性期反应等免疫反应。系统进化分析显示,斑马鱼C2/Bf三个基因亚型中,Bfl同哺乳动物的C2处于同一进化分支,而Bf2及Bf3与哺乳动物B因子亲缘关心更近。在LPS刺激后Bf2及Bf3反应较快,而与C2相似的Bfl反应慢,同时参与经典途径和凝集素途径的C4基因反应无规律,由此推测斑马鱼早期胚胎发育过程中针对外界炎症反应物刺激,补体系统的激活主要经由替代途径。这可能同鱼类中替代途径的高滴度和替代途径本身在进化上的原始性有关。此外,有研究表明B因子的三个亚型均由一个共同基因复制而来,RCA家族的两个基因也是如此。在LPS刺激后,这几个基因同其亚型的反应均不相同。表明斑马鱼Bf/C2三个亚型间及RCA2.1、RCA2.2两补体调节基因间不是简单的复制基因,而是已经有表达差异和功能分化。总之,本文首次报道了斑马鱼补体基因在早期胚胎中的表达图式及其在LPS刺激下的表达模式,表明在斑马鱼早期胚胎发育过程中可通过替代途径进行补体激活,并可进行补体因子的调节,为深入研究鱼类补体系统发育提供了新的信息。
【关键词】：补体 斑马鱼 胚胎 LPS 表达模式
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1 模式生物斑马鱼11-12
• 1.1 基本特征11
• 1.2 免疫学研究11-12
• 2 补体系统概述12-21
• 2.1 发现及命名12
• 2.2 补体活化12-15
• 2.2.1 经典途径13-14
• 2.2.2 凝集素途径14
• 2.2.3 替代途径14-15
• 2.2.4 终末途径15
• 2.3 补体激活调控及调控因子15-17
• 2.3.1 补体激活途径调节16-17
• 2.3.2 补体终末途径调节17
• 2.4 鱼类补体17-21
• 2.4.1 鱼类补体特点18
• 2.4.2 鱼类补体主要成分18-21
• 3 研究目的与技术路线21-23
• 3.1 研究目的21-22
• 3.2 技术路线22-23
• 第二章 斑马鱼补体基因在早期胚胎中的表达图式及LPS刺激下的表达模式23-80
• 1 前言23-24
• 2 材料与方法24-51
• 2.1 实验材料与仪器24-26
• 2.1.1 斑马鱼24
• 2.1.2 主要实验试剂24-25
• 2.1.3 主要实验仪器耗材25-26
• 2.2 实验方法26-51
• 2.2.1 斑马鱼补体及其调节因子基因和蛋白生物信息学分析26-27
• 2.2.2 斑马鱼各时期胚胎mRNA提取与cDNA制备27-31
• 2.2.3 斑马鱼补体和其调节因子基因扩增及mRNA探针制备31-42
• 2.2.4 斑马鱼早期胚胎原位杂交42-46
• 2.2.5 斑马鱼补体基因real-time PCR检测LPS刺激下表达量变化46-51
• 3 实验结果51-77
• 3.1 补体及其调节因子基因生物信息学分析51-64
• 3.1.1 补体及其调节因子基因序列分析51-53
• 3.1.2 补体及其调节因子蛋白序列及结构分析53-61
• 3.1.3 补体及其调节因子基因蛋白序列同源比对61-64
• 3.2 斑马鱼各时期胚胎mRNA提取与cDNA制备64-65
• 3.3 斑马鱼补体和其调节因子基因扩增及mRNA探针制备65-66
• 3.4 斑马鱼早期胚胎原位杂交66-72
• 3.5 斑马鱼补体基因real-time PCR检测LPS刺激下表达量变化72-77
• 4 讨论77-80
• 小结80-81
• 参考文献81-88
• 附录88-90
• 致谢90-91
• 个人简历91
• 发表的学术论文91

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