H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

发布时间：2020-07-24 08:10

【摘要】：禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)感染禽类后引起的一种疾病综合征,包括呼吸道、消化道、产蛋量下降或免疫抑制等疾病,可分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感三类。虽然H9N2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感,但疫病在我国广泛流行,且还发生了多起感染人的事件。由于H9N2禽流感病毒具有频繁变异与重组的特性,不仅给养殖业造成了巨大的损失,同时也严重威胁着人类的生命安全。预防和控制禽流感最有效的手段就是接种疫苗,目前国内比较常见的用来制备H9N2亚型禽流感的疫苗株主要是A/Chicken/Shanghai/F/98(F株)与A/Chicken/Shanghai/6/96等。这些毒株均是08年之前分离的,与现在流行株的抗原性差异非常大,因而疫苗急需升级换代。本试验从2013年在浙江、安徽、安徽等地活禽市场所采样品中分离获得8个H9 AIV分离株。这些H9N2禽流感毒株通过10倍稀释,分别经接种鸡胚尿囊腔接种,最后取尿囊液血凝效价最高的进行下一轮的纯化。三次纯化后,收集最高稀释度和血凝效价的鸡胚尿囊液,存放于-80度冰箱。通过鸡胚尿囊RNA的提取后,经过反转录、PCR等获得所需要的目的基因片段(其中PB2、 PB1、PA、HA、NP基因分成两段扩增)。PCR产物割胶回收并纯化,并送上海美吉公司进行测序。序列测定完成后用DNAstar软件中的SeqMan程序进行序列拼接、用MegAlign程序对拼接后的序列序列进行同源性分析。并用Mega6软件绘制进化树,分析不同年份、不同地域的H9N2亚型AIV流行毒株的遗传进化。结果表明：这8株分离株它们之间的HA基因的同源性为95.7-100%,氨基酸的同源性为96.4-99.8%,NA的核苷酸同源性在93.7%-99.8%之间,氨基酸的的同源性为93.1%-99.8%,NS的核苷酸同源性为95.3%-100%,M的核苷酸同源性为98.2%-100%、NP的核苷酸同源性为95.3%-100%、PA的核苷酸同源性为97.2%-100%、PB1的核苷酸同源性为96.1%-100%、PB2的核苷酸同源性为96.1%-100%。遗传进化分析结果表明,这8株H9N2亚型禽流感病毒株的HA、NA、 NS、M、NP、PA、PB1、PB2基因均属于同一亚系分支,具有较高的同一性。但这些H9N2 AIV与之前的疫苗毒(F株)的HA基因的遗传关系较远,不在同一分支上。结论：现在的H9N2 AIV流行株在抗原性方面较为一致,但与过去毒株的抗原性相差甚远；这些H9N2 AIV流行株的获得,为新的H9 AIV疫苗研制奠定了毒株的基础。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2768557