桑树PCS基因功能及桑树转基因技术研究

发布时间：2017-03-30 17:12

  本文关键词：桑树PCS基因功能及桑树转基因技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物螯合肽是一类富含半胱氨酸的多肽化合物,存在于绝大多数高等植物及一些动物和真菌中。由于富含Cys使得其能够通过巯基与金属结合形成络合物,从而具有增强植物重金属耐受性、解除或降低重金属对植物的毒性以及维持细胞内外环境金属离子浓度的相对稳定的功能。植物螯合肽的结构通常以y-Glu-Cys二肽为重复单位并且在其C-末端以Gly为结尾,基本结构为(y-Glu-Cys) n-Gly,其中n通常在2到5之间变化,n最大可达11。植物螯合肽是以谷胱甘肽(GSH)为底物在植物螯合肽合成酶的催化下合成的。随着全球重金属污染的日益严重,通过植物修复缓解重金属污染备受关注,到目前为止,已经在多种植物、动物及真菌中发现植物螯合肽合成酶基因(PCS),研究表明PCS在提高重金属抗性及累积量方面具有重要作用。虽然PCS的研究逐渐增多,但主要集中在草本及禾本植物中,对重金属具有较强耐受性的木本植物中研究却尚未报道。桑树(Morus L.)作为我国一种重要的林木树种,对恶劣自然环境有超强适应性,并且具有耐干旱、耐盐碱、耐贫瘠、生命力强、生长速度等特点。有研究发现桑树对于大气中存在的镉和铅的吸收量均较多；受到重金属影响的桑叶能够继续饲喂家蚕并且对家蚕个体及丝的各项指标均无影响。可见桑树在解决和缓解重金属污染问题方面存在巨大的潜力。然而桑树乃至木本植物中PCS的研究至今仍未见报道。桑树中PCS的研究不仅能够完善PCS基因在提高重金属抗性及积累量方面的应用,进一步探究和完善植物螯合肽的解毒机理,而且还为桑树种植资源筛选和生态经济价值的实现建立良好的基础,为桑树作为一种有效解决和缓解重金属污染的绿化树种提供重要依据。植物转基因技术是基因功能研究及素材创新的重要技术之一。但是到目前为止,桑树转基因技术研究受到植物组织培养严格繁琐操作和桑树再生系统难以建立的限制,目前还只能在个别桑树品种(如再生能力强的印度桑和新一之濑)中获得成功,而且这些技术可重复性较差,目前只在极少几个研究小组中取得了突破,还难以有效的应用于桑树功能基因组研究和素材创新研究中。因此急需一套高效实用的桑树转基因技术体系用于相关研究。基于以上考虑,本研究首先通过生物信息学的手段从川桑数据库中检索鉴定得到桑树植物螯合肽合成酶基因,并对其进行相关的生物信息学分析。同时利用qRT-PCR技术研究了桂优62桑品种在受到重金属胁迫下的表达模式。再利用模式植物烟草对桑树PCS基因进行相应功能研究。其次,通过注射桑树冬芽的方法对桑树转基因技术进行了探索。本研究的主要结果如下：1、川桑PCS基因的鉴定及生物信息学分析通过生物信息学的方法,我们在川桑基因组中鉴定得到2个桑树植物螯合肽合成酶基因,与拟南芥中PCS基因个数相同。之后分别以川桑6个组织cDNA为模板克隆得到了这2个基因,经测序验证结果表明与川桑数据库中的序列信息一致。MnPCS1预测蛋白分子量为55.8kDa,MnPCS2预测蛋白分子量为55.2kDa。这与PCS基因蛋白量40kDa-70kDa相吻合。在数据库中检索得到PCS基因在不同组的表达情况。其中,MnPCS1基因在皮中表达量最高,在叶中表达量最低；MnPCS2基因在花中表达量最高,在芽中表达量最低。基因结构分析表明2个PCS基因都为多外显子基因,且都含有8个外显子。结构域预测结果表明它们与已发现的PCS基因一样拥有高度保守的N-末端催化结构域和可变的C-末端,并且在其C-末端含有较多的半胱氨酸残基,它们大都以成对或近似成对的形式存在。其中MnPCS1 C-末端含有12个Cys残基,MnPCS2 C-末端含有9个Cys残基,Cys残基数较拟南芥中的2个基因要多,值得注意的是MnPCS2 C-末端的Cys残基排布情况与其他植物PCS的有较大差异。系统发生分析结果表明MnPCS1与蔷薇目杜梨的PbPCS1聚为一支,这与桑树应分为蔷薇目的结果相一致；MnPCS2与盐地碱蓬聚为一支。2、桑树PCS基因胁迫诱导表达分析以川桑PCS基因序列为依据设计克隆引物,以桂优62桑品种cDNA为模板,克隆桂优62桑品种中PCS基因,经测序得到序列后与川桑PCS基因进行多重序列比对,结果表明,两个桑树品种中PCS蛋白序列具有高度保守性,相似性高达99.8%和96.4%。此后,以测序得到的桂优62桑品种PCS基因序列为依据设计定量引物,以桂优62桑品种为实验对象,对其进行Zn2+胁迫处理,qRT-PCR结果表明桂优62中的PCS基因在受到Zn2+金属胁迫诱导后,其在24h内的表达模式基本都是先降低后增高再降低。但MnPCS1在8h根和茎中相对表达量最高,而在叶中则是12h最高；MnPCS2在叶和茎中2h相对表达量最大,在根中则是8h达到最大。桑树MaPCS1在根中的相对表达量较茎和叶都要高,这与已报道的PCS在不同组织的表达量相一致；而MaPCS2则是叶中的相对表达量最高。与川桑转录组数据中两个基因的相对表达量及趋势相类似。分析表明桂优62中PCS基因在桑树受到Zn2+胁迫诱导后能迅速响应共同发挥作用,但在不同组织其行使的功能可能不同。3、桑树PCS基因的功能研究分别利用蘸花法和叶盘转化法获得了MnPCS1和MnPCS2转基因拟南芥和转基因烟草株系,通过基因组PCR和qRT-PCR鉴定后,选择其中表达量最高和最低的进行后续基因功能研究。研究结果表明,在重金属胁迫下,转基因拟南芥MnPCS1转基因株系按目的基因表达量高低其平均根长分别为1.47cm和1.65cm均较野生型平均根长0.97cm长,每10株鲜重平均值也分别为209mg和220mg均较野生型174.4mg重；MnPCS2转基因株系按目的基因表达量高低其平均根长分别为1.58cm和1.57cm均较野生型平均根长1cm长,每10株鲜重平均值也分别为244mg和288mg均较野生型174.4mg重。MnPCSl转基因系对Zn离子的积累量按目的基因表达量高低分别为0.223mg/kg和0.122mg/kg,MnPCS2转基因系分别为0.261mg/kg和0.248mg/kg,都较野生型0.027mg/kg高出1个数量级。转基因烟草MnPCSl转基因株系按目的基因表达量高低其平均根长分别为1.98cm和1.52cm均较野生型平均根长0.98cm长,每3株鲜重平均值也分别为302mg和243mg均较野生型147mg重；MnPCS2转基因株系按目的基因表达量高低其平均根长分别为2.25cm和1.93cm均较野生型平均根长0.98cm长,每3株鲜重平均值也分别为260mg和207mg均较野生型147mg重。综上所述,桑树PCS基因能够显著的提高植株对重金属的抗性和地上部分对重金属的累积量。4、桑树转基因技术将农杆菌直接微量注射到珍珠白和红果1号桑品种冬芽中,对其后代进行基因组PCR、 qRT-PCR和Southern blotting检测,以筛选出阳性枝条；并通过人工授粉的方法收取桑树T1代种子,并对其进行基因组PCR检测以最终确定阳性转基因株系。结果表明,该方法可以免去诸如组织培养的繁琐步骤以及无菌的操作环境等要求,直接在植株上进行,在自然环境下即可完成,成本低廉,操作简单,技术要领掌握容易,转化效率较高,能够快速获得适宜当地野外自然条件的转基因植株、苗木及种子,可适用于不同桑树品种的基因转化。本研究利用生物信息学方法鉴定得到了2个桑树植物螯合肽合成酶基因,通过与其他植物中的PCS基因比对发现,这些基因的结构域具有较高的保守性,暗示了其功能的一致性。通过重金属胁迫桂优62桑品种结合qRT-PCR技术探明了桑树中PCS基因的表达模式。并且推测2个基因在不同组织其行使的功能可能不同。转基因实验表明桑树PCS基因能够显著的提高拟南芥和烟草的重金属抗性和地上部分重金属的累积量。本研究开发的基于农杆菌介导的冬芽注射的桑树转基因方法提供了一种简单易行,可克服组织培养和再生系统的限制,能够在自然环境中大规模进行的桑树转基因研究技术。本研究首次在木本植物中研究了植物螫合肽合成酶基因,进一步证明和完善了PCS基因在提高重金属抗性和累积量方面的重要作用,为桑树种植资源筛选和解决重金属污染奠定了基础。同时冬芽注射的桑树转基因方法也为桑树高效实用转基因技术体系的建立和完善打下了良好基础。
【关键词】：桑树 植物螯合肽合成酶基因 生物信息学 表达分析 功能研究 转基因技术
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S888;Q943.2
【目录】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-16
• 第一章 文献综述16-26
• 1.1 重金属危害及污染现状16-17
• 1.1.1 重金属及其危害性16
• 1.1.2 污染来源及现状16-17
• 1.2 土壤重金属污染治理修复17-18
• 1.2.1 传统修复17
• 1.2.2 生物修复17-18
• 1.3 植物螯合肽18-23
• 1.3.1 PCs的作用19-20
• 1.3.2 PCs生物合成与解毒机理20-21
• 1.3.3 植物螯合肽合成酶(PCS)21-23
• 1.4 桑树重金属耐受性及研究动态23-24
• 1.5 植物转基因技术24
• 1.6 桑树转基因技术研究现状24-26
• 第二章 引言26-30
• 2.1 研究背景及意义26-27
• 2.2 主要研究内容27-28
• 2.3 技术路线28-30
• 第三章 川桑PCS基因生物信息学分析30-42
• 3.1 材料与试剂30-32
• 3.1.1 材料30
• 3.1.2 基因序列信息的获得30
• 3.1.3 主要信息学分析软件30
• 3.1.4 主要试剂及溶液的配制方法30-32
• 3.1.5 主要仪器32
• 3.2 方法32-36
• 3.2.1 川桑PCS基因的鉴定32-33
• 3.2.2 RNA的提取及质量检测33
• 3.2.3 cDNA第一链合成33
• 3.2.4 川桑PCS基因的克隆33-36
• 3.2.5 PCS基因的对序列比对及系统发生分析36
• 3.3 结果与分析36-40
• 3.3.1 川桑PCS基因的鉴定预测36-37
• 3.3.2 桑树植物螯合肽合成酶基因在川桑不同组织的表达分析37-38
• 3.3.3 桑树植物螯合肽合成酶基因的克隆及信息学分析38-40
• 3.4 小结与讨论40-42
• 第四章 桑树PCS基因胁迫诱导表达分析42-50
• 4.1 材料与主要试剂仪器42-43
• 4.1.1 材料42
• 4.1.2 实验方法42
• 4.1.3 主要试剂42-43
• 4.1.4 主要仪器43
• 4.2 实验方法43-45
• 4.2.1 RNA的提取及质量检测43
• 4.2.2 cDNA第一链的合成43-44
• 4.2.3 荧光定量PCR(qRT-PCR)44
• 4.2.4 qRT-PCR44
• 4.2.5 结果计算44-45
• 4.3 结果与分析45-48
• 4.3.1 MaPCS145-46
• 4.3.2 MaPCS246-48
• 4.4 小结与讨论48-50
• 第五章 桑树植物螯合肽合成酶基因的遗传转化及功能研究50-82
• 5.1 实验材料与主要试剂50-57
• 5.1.1 实验材料50
• 5.1.2 主要试剂及溶液配制方法50-56
• 5.1.2.1 主要试剂50-56
• 5.1.3 主要仪器56-57
• 5.2 实验方法57-65
• 5.2.1 转基因过表达载体的构建57-59
• 5.2.2 农杆菌感受态细胞的制备与转化59-60
• 5.2.3 农杆菌的检测及甘油菌农杆菌的制备60
• 5.2.4 拟南芥的种植及转化60-61
• 5.2.5 烟草叶盘转化法61-62
• 5.2.6 转基因阳性植株的分子鉴定62-64
• 5.2.7 桑树植物螯合肽合成酶基因的功能研究64-65
• 5.3 结果与分析65-80
• 5.3.1 桑树植物螯合肽合成酶基因的转基因载体构建65-66
• 5.3.2 桑树植物螯合肽合成酶基因在拟南芥中的过表达66-70
• 5.3.3 桑树植物螯合肽合成酶基因在烟草中的过表达70-73
• 5.3.4 转基因植株中基因的功能研究73-80
• 5.4 小结与讨论80-82
• 第六章 桑树转基因技术82-96
• 6.1 实验材料与试剂82-85
• 6.1.1 实验材料82
• 6.1.2 主要试剂及溶液配制方法82-84
• 6.1.3 主要仪器84-85
• 6.2 实验方法85-90
• 6.2.1 桑树注射转化85
• 6.2.2 桑树套袋、人工授粉及种子的收集85-86
• 6.2.3 桑树种子的种植与筛选86
• 6.2.4 基因组PCR检测86-87
• 6.2.5 转基因桑树的qRT-PCR检测87
• 6.2.6 Southern blotting检测87-90
• 6.3 结果与分析90-94
• 6.3.1 桑树冬芽注射统计90-91
• 6.3.2 阳性个体筛选及分子鉴定91-92
• 6.3.3 T2代桑树幼苗阳性鉴定92-94
• 6.3.4 阳性植株分子鉴定94
• 6.4 小结与讨论94-96
• 第七章 综合与讨论96-100
• 参考文献100-108
• 附录108-110
• 在读期间发表论文及参加课题110-112
• 致谢112-113

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