裂殖壶菌培养基氮源的优化及PKS酶域过表达菌株的构建

发布时间：2020-08-26 00:32

【摘要】：裂殖壶菌(A urantiochytrium limacinum)又称裂壶藻,是一种海洋真菌,细胞内含有大量的油脂,其中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,简称DHA)含量最多。DHA是一种是重要的n-3多不饱和脂肪酸,能促进婴幼儿大脑和视网膜的发育及成熟,并且对老年人降低血脂、预防心血管疾病等有明显作用。由于裂殖壶菌容易培养,生长速度快,并且细胞内的DHA含量高等优点,成为微生物发酵生产DHA的优良菌种。本论文从裂殖壶菌培养基中氮源的优化、聚酮合酶(PKS)基因的克隆以及转化等方面进行研究,为降低裂殖壶菌生产DHA的成本,提高裂殖壶菌生物量、DHA含量奠定基础。实验室前期成功实现了豆粕水解物做裂殖壶菌发酵中的氮源,替代了酵母提取物,降低了生产成本,但是豆粕水解液的制备需要酸解,易腐蚀设备,而且操作繁琐。因此迫切要求寻找适宜的廉价氮源以满足工业生产的要求。本研究以裂殖壶菌Aurantiochytrium limacinum OUC168为实验菌株,首次以玉米浆干粉做氮源进行培养实验,结果裂殖壶菌在以酵母提取物(20g/L)做氮源的培养基上生物量为4.40 g/L·d, DHA含量是8.95%；在玉米浆干粉(20g/L)做氮源的培养基上生物量是4.13g/L·d, DHA含量是8.72%,由于玉米浆干粉的价格是酵母提取物的十分之一,在生物量和DHA含量差幅不大的情况下,大大降低了发酵生产的成本,对工业化生产有重要意义。进一步以玉米浆干粉、谷氨酸钠、葡萄糖这三个因素设计正交试验,结果葡萄糖120g/L、玉米浆干粉15g/L、谷氨酸钠20g/L得到了最高的生物量和DHA含量,分别为5.48g/L·d和12.50%,为以后的发酵生产提供了理论基础。聚酮合酶(PKS)是裂殖壶菌合成多不饱和脂肪酸的一个关键酶,本研究采用Genome walking方法,克隆得到了完整的pksl (4386bp)基因序列。并首次克隆得到了含有CAAT-box和TATA-box等启动子元件的pks1基因的启动子序列。为从分子水平研究和改造裂殖壶菌来提高DHA的合成奠定了基础。将本研究中获得的pks1序列与实验室前期获得的pks2序列进行比对,发现在2991bp--4386bp处序列相似性很高,达78%,该序列经BLAST比对属于丙二酰转移酶酶域,具有将丙二酸单酰-CoA装载到酰基载体蛋白(ACP)的功能,该序列在两段pks基因中都存在,推测其在DHA合成中具有重要作用,因此本研究将该序列构建同源重组载体p18SCPGC-1,转化裂殖壶菌,使其在裂殖壶菌中过量表达。通过对转化菌株进行细胞形态、生长曲线、生物量及DHA含量的性状分析,结果显示转化菌株生物量为5.02g/L·d,比未转化菌株提高14.6%,转化菌株的DHA含量是17.11%,比未转化菌株提高37.90%。本文首次成功使用玉米浆干粉作为氮源来培养裂殖壶菌,为降低生产成本,提高裂殖壶菌的工业化生产水平提供了实验依据；对pks1基因的克隆分析及构建酶域过表达菌株为研究DHA合成过程中相关酶的功能,并为基因工程方法制备高产DHA菌株奠定了基础。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93;Q78

【参考文献】