拟南芥FRS6和FRS8调控下胚轴伸长的分子机制
发布时间：2020-10-28 02:47
拟南芥FRS(FAR1-related sequences)蛋白家族包含FHY3和FAR1以及FRS1至FRS12共14个家族成员。FRS蛋白家族的序列具有高度同源性以及含有保守的二级结构域,其家族成员具有核定位信号和卷曲螺旋结构域,并且在莲座叶、茎生叶、花序茎和花等组织中表达,参与调节植物的生长发育。前人研究发现,拟南芥FRS6和FRS8可能负调控开花时间,但是下游靶基因和潜在的分子机制尚不清楚。本研究通过观察FRS6和FRS8的突变体(frs6、frs8、frs6 frs8)和FRS6过表达株系(FRS6-OE-L1、FRS6-OE-L3)的表型,未发现如文章报道明显开花表型,但是发现frs6、frs8和frs6 frs8具有短下胚轴表型,FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3具有长下胚轴表型,在此基础上利用分子生物学和生物化学等方法探究FRS6和FRS8在下胚轴伸长过程中的作用机制,主要结果如下:亚细胞定位发现FRS6和FRS8定位细胞核;GUS染色发现在拟南芥幼苗时期FRS6和FRS8主要在根、子叶叶脉和尖端以及下胚轴中表达,在成苗时期主要在茎、叶片尖端、花及叶柄中表达。表型观察发现,无论长日照还是短日照,与野生型Col-0相比,frs6、frs8和frs6 frs8下胚轴短,而FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚轴长。经不同光质处理发现,红光处理较白光处理表型差异更明显,而远红光与蓝光处理,下胚轴长度无明显差异,表明FRS6和FRS8通过响应红光信号转导途径正调控拟南芥下胚轴伸长过程。酵母双杂交实验发现FRS6与FRS8能够形成同源或异源二聚体,但不与红光受体phyB相互作用;酵母筛库发现HISTONE DEACETYLASE 15(HDA15)与FRS6和FRS8相互作用,并通过酵母双杂交实验验证。前人研究表明,红光条件下,HDA15是下胚轴伸长的负调控因子,因此HDA15与FRS6和FRS8可能在响应红光信号转导途径调控拟南芥下胚轴伸长过程中起相互拮抗作用。施加生长素(IAA)和生长素抑制剂(NPA)后,与野生型Col-0相比,frs6、frs8、frs6 frs8和FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚轴长度变化量无明显差异;施加GA后FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚轴有明显伸长,施加PAC后其下胚轴伸长受到明显抑制。赤霉素合成相关基因在FRS6-OE--L1和FRS6-OE--L3中表达上调,在frs6中表达下调。酵母单杂交实验证实FRS6和FRS8能够结合赤霉素合成基因GA20OX4启动子,表明FRS6和FRS8可能通过调节赤霉素合成基因的表达调控下胚轴伸长。综上所述,拟南芥FRS6和FRS8在植物生长发育过程中发挥重要作用。FRS6和FRS8定位于细胞核,两者相互作用,与HDA15结合,红光下相互拮抗调节植物下胚轴伸长。同时,FRS6和FRS8结合GA20OX4启动子参与赤霉素合成,调控下胚轴伸长。对FRS6和FRS8的研究,有利于理解下胚轴伸长的调节机制,同时为FRS蛋白家族其它成员的功能探究提供新的思路。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：
山东农业大学硕士学位论文51前言1.1FRS蛋白家族1.1.1FRS蛋白家族概述FRS（FAR1-relatedsequences）蛋白家族由FAR-REDELONGATEDHYPOCOTYLS3（FHY3）和FAR-REDIMPAIREDRESPONSE1（FAR1），以及FRS1至FRS12共14个成员组成（Initiative,2000）。根据多序列比对和保守的蛋白基序分析将拟南芥FRS蛋白家族分为五个亚组，分别为组1（FHY3、FAR1、FRS1、FRS2和FRS4），组2（FRS6和FRS8），组3（FRS7和FRS12），组4（FRS3、FRS5和FRS9），组5（FRS10和FRS11）（图1-1）。序列同源性和家庭成员之间保守的二级结构表明，这组蛋白可能参与响应生物与非生物胁迫的信号转导过程。在其他物种如单子叶植物中鉴定出FRS同源蛋白，表明该蛋白家族在植物界的整个进化过程中是保守的。推测FRS蛋白家族在植物生长和发育过程中扮演着重要角色（Hudsonetal.,1999;WangandDeng,2002）。图1-1拟南芥FRS家族进化树（LinandWang,2004）Fig.1-1ThephylogenetictreeofFRSfamilyinArabidopsisthaliana（LinandWang,2004）1.1.2FRS蛋白家族结构和DNA结合活性分析FRS家族的大多数成员均有N末端C2H2锌指结构域（也称为FAR1DNA结合结构域），以及C末端SWIM（SWI2/SNF2和MuDR转座酶）锌指结构域。另外，C2H2锌指结构域是一种类似于MULE转座酶的中央转座酶结构域（LinandWang,2004;Linetal.,2007）（图1-2）。家族成员FHY3的N端或C端结构域的异位过表达会导致拟南芥幼苗出现长下胚轴表型，当FHY3只有C端过表达时，则表现在远红光下完全黄化的表型。表明FHY3的C末端片段的过表达会损害FHY3内源性的功能（WangandDeng,
拟南芥FRS6和FRS8调控下胚轴伸长的分子机制62002）。另外，FHY3的DNA结合结构域位于N端，可直接与FAR-REDELONGATEDHYPOCOTYLS1（FHY1）和FHY1-LIKE（FHL）启动子结合并促进其基因表达，从而间接影响phyA向核内的转运（Linetal.,2007），表明这两个结构域对于FRS家族蛋白功能以及转录活性至关重要。图1-2FRS家族蛋白保守结构域（MaandLi,2018）Fig.1-2ConservedproteindomainofFRSfamilyproteins（MaandLi,2018）具有代表性的FRS家族蛋白FHY3和FAR1与FHY3/FAR1结合位点（FBS,CACGCGC）顺式元件结合，这些顺式元件位于包括FHY1、FHL、EARLY-FLOWERING4（ELF4）、ACCUMULATIONANDREPLICATIONOFCHLOROPLASTS5（ARC5）、CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1（COP1）等在内的靶基因的启动子区域（Linetal.,2007;Lietal.,2011a;Ouyangetal.,2011;Huangetal.,2012;Gaoetal.,2013），FRS4/CPD25也可以与ARC5启动子中的FBS或FBS-like（FBL）顺式元件结合（Gaoetal.,2013）。家族中的FRS12可以特异性识别PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR4（PIF4），GIGANTEA（GI）和PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3-LIKE1（PIL1）启动子中的FRS12-BOX修饰位点（FRB1,TGTGTG;FRB2,TATATATATATATATATAT,FRB3,TATACATA）（Ritteretal.,2017）。1.1.3FRS蛋白家族的定位及表达分析大多数FRS蛋白包含一个或两个具有四个氨基酸残基的核定位信号序列（NLSs）。这些NLSs位于某些FRS蛋白（FRS2、FRS7和FRS12）C端或在其他FRS蛋白（FRS3、FRS4、FRS5、FRS10和FRS11）N端，但FRS8既不具有卷曲螺旋结构域也不具有NLSs，
山东农业大学硕士学位论文11是调节响应R的主要光敏色素。在光照条件下，这些光敏色素可抑制光信号的两个主要分支：COP1-TFs和PIFs。COP1是一种E3泛素连接酶，光照条件下会受到phyB的抑制，COP1靶向几种促进光形态发生的转录因子如HY5、HY5HOMOLOG（HYH）、LONGAFTERFAR–REDLIGHT1（LAF1）和LONGHYPOCOTYLINFAR–RED1（HFR1）的降解，PIFs可被COP1靶向降解，并且PIFs通过促进COP1/phyB相互作用进而促使phyB降解（图1-3）。图1-3植物色素信号传导途径的简化模型（Lietal.,2011b）Fig.1-3Asimplifiedmodelofthephytochromesignalingpathway（Lietal.,2011b）1.2.1.1phyA介导远红光对下胚轴的调控phyA是介导植物对远红光（FR）各种响应的主要感光受体，抑制拟南芥下胚轴伸长，促进顶端弯钩的出现，使子叶打开，促进花青素的积累（Nagatanietal.,1993;Whitelametal.,1993）。远红光下phyA通过穿梭蛋白FHY1和FHL从细胞质进入到细胞核（SheerinandHiltbrunner,2017）。分子遗传学研究加深了我们对phyA信号传导的理解，特别是关于phyA与光响应基因以及与光形态建成相关基因，这些包括PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3（PIF3）、POLYKETIDESYNTHHASE1（PKS1）、（NUCLEOSIDEDIPHOSPHATEKINASE2）NDPK2，隐色色素CRYPTOCHROME1（CRY1）和CRYPTOCHROME2（CRY2）和AUX/IAA蛋白（Colón-Carmonaetal.,2000;Quail,2000）。研究表明，远红光下phyA抑制下胚轴伸长，FHY3和FAR1被确定为拟南芥中phyA介导的远红光信号转导关键成分，在phyA介导的远红光信号通路中FHY3和FAR1抑制下胚轴的伸长（WangandDeng,2002）。
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本文编号：2859459
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拟南芥FRS6和FRS8调控下胚轴伸长的分子机制62002）。另外，FHY3的DNA结合结构域位于N端，可直接与FAR-REDELONGATEDHYPOCOTYLS1（FHY1）和FHY1-LIKE（FHL）启动子结合并促进其基因表达，从而间接影响phyA向核内的转运（Linetal.,2007），表明这两个结构域对于FRS家族蛋白功能以及转录活性至关重要。图1-2FRS家族蛋白保守结构域（MaandLi,2018）Fig.1-2ConservedproteindomainofFRSfamilyproteins（MaandLi,2018）具有代表性的FRS家族蛋白FHY3和FAR1与FHY3/FAR1结合位点（FBS,CACGCGC）顺式元件结合，这些顺式元件位于包括FHY1、FHL、EARLY-FLOWERING4（ELF4）、ACCUMULATIONANDREPLICATIONOFCHLOROPLASTS5（ARC5）、CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1（COP1）等在内的靶基因的启动子区域（Linetal.,2007;Lietal.,2011a;Ouyangetal.,2011;Huangetal.,2012;Gaoetal.,2013），FRS4/CPD25也可以与ARC5启动子中的FBS或FBS-like（FBL）顺式元件结合（Gaoetal.,2013）。家族中的FRS12可以特异性识别PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR4（PIF4），GIGANTEA（GI）和PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3-LIKE1（PIL1）启动子中的FRS12-BOX修饰位点（FRB1,TGTGTG;FRB2,TATATATATATATATATAT,FRB3,TATACATA）（Ritteretal.,2017）。1.1.3FRS蛋白家族的定位及表达分析大多数FRS蛋白包含一个或两个具有四个氨基酸残基的核定位信号序列（NLSs）。这些NLSs位于某些FRS蛋白（FRS2、FRS7和FRS12）C端或在其他FRS蛋白（FRS3、FRS4、FRS5、FRS10和FRS11）N端，但FRS8既不具有卷曲螺旋结构域也不具有NLSs，
山东农业大学硕士学位论文11是调节响应R的主要光敏色素。在光照条件下，这些光敏色素可抑制光信号的两个主要分支：COP1-TFs和PIFs。COP1是一种E3泛素连接酶，光照条件下会受到phyB的抑制，COP1靶向几种促进光形态发生的转录因子如HY5、HY5HOMOLOG（HYH）、LONGAFTERFAR–REDLIGHT1（LAF1）和LONGHYPOCOTYLINFAR–RED1（HFR1）的降解，PIFs可被COP1靶向降解，并且PIFs通过促进COP1/phyB相互作用进而促使phyB降解（图1-3）。图1-3植物色素信号传导途径的简化模型（Lietal.,2011b）Fig.1-3Asimplifiedmodelofthephytochromesignalingpathway（Lietal.,2011b）1.2.1.1phyA介导远红光对下胚轴的调控phyA是介导植物对远红光（FR）各种响应的主要感光受体，抑制拟南芥下胚轴伸长，促进顶端弯钩的出现，使子叶打开，促进花青素的积累（Nagatanietal.,1993;Whitelametal.,1993）。远红光下phyA通过穿梭蛋白FHY1和FHL从细胞质进入到细胞核（SheerinandHiltbrunner,2017）。分子遗传学研究加深了我们对phyA信号传导的理解，特别是关于phyA与光响应基因以及与光形态建成相关基因，这些包括PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3（PIF3）、POLYKETIDESYNTHHASE1（PKS1）、（NUCLEOSIDEDIPHOSPHATEKINASE2）NDPK2，隐色色素CRYPTOCHROME1（CRY1）和CRYPTOCHROME2（CRY2）和AUX/IAA蛋白（Colón-Carmonaetal.,2000;Quail,2000）。研究表明，远红光下phyA抑制下胚轴伸长，FHY3和FAR1被确定为拟南芥中phyA介导的远红光信号转导关键成分，在phyA介导的远红光信号通路中FHY3和FAR1抑制下胚轴的伸长（WangandDeng,2002）。
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本文编号：2859459
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