拟南芥SHB1在红光下调控GRF7基因表达的机制研究

发布时间：2020-11-06 18:18

　　 自然界中的植物生长发育需要光照、温度、湿度等外界条件,高等植物通过吸收红光和远红光的光敏色素及吸收蓝光和紫外-A的隐花色素响应环境。早期在红光、蓝光和远红光条件下筛选到一个长下胚轴功能获得型突变体shb1-D并克隆得到SHB1基因。SHB1基因定位于细胞核中,目前对于SHB1基因功能的阐释多集中于其调控种子胚乳发育方面,而对其参与植物光信号转导的机制不甚清楚。我们之前的研究发现PIF4作为SHB1下游的一个直接靶基因,其表达受到SHB1-CCA1/LHY模块的调控,从而促进植物达到光形态建成的平衡状态。在本研究中,我们以shb1-D突变体和野生型Ws为实验材料进行转录组学测序与数据分析,并从中鉴定得到SHB1的另一个靶基因GRF7。本研究主要探索了SHB1在红光下调控GRF7基因表达的分子机制,取得结果如下:(1)RNA-Seq结果分析显示,在shb1-D突变体背景下共有823个差异表达基因(︱FC︱1.5,P0.05),表达上调的基因有586个,表达下调的基因有237个。对这些差异表达基因进行聚类分析,这些基因主要在分子生物学功能、生物学过程、细胞组分这些途径中均有分布。在参与的分子生物学功能方面这些差异基因多分布在结合、催化、电子载体活动和转运活性方面;在参与的生物学过程方面这些差异基因多分布在生物学过程的调控、细胞过程、代谢过程、信号传递过程等方面;在参与构成细胞组分方面这些差异基因多分布在细胞分离、胞外区域、膜镶嵌区域等方面。(2)这些差异表达基因中包含标志基因PIF4,利用qRT-PCR技术验证了一些随机筛选的差异表达基因,包括HEMB2、HEC2、CLE19、GRXS2、CO、XTH6的表达情况,结果显示与RNA-Seq数据结果一致,因此本次测序结果是可信的。(3)在上调表达的差异基因中发现4个GRF基因家族成员(GRF4/5/6/7),其表达水平在shb1-D突变体中均上调。其中,GRF7基因的表达明显受到光信号的抑制而在shb1-D突变体中显著升高。利用qRT-PCR技术分别在野生型Ws与突变体shb1-D中分析GRF7基因在红光、蓝光、远红光的强光(15μmol/m~2/s)与弱光(2μmol/m~2/s)条件下的表达状况。结果显示在红光条件下的表达状况与RNA-Seq结果一致,并且在蓝光、远红光的强光与弱光条件下GRF7基因的表达均受到明显的光抑制,且在shb1-D突变体中GRF7基因的表达显著升高。暗示着GRF7基因可能会参与植物的光信号转导信号通路。(4)观察grf7突变体与野生型Col在黑暗和红光条件下的表型,与Col野生型相比,在红光条件下grf7单突变体下胚轴长度明显降低,暗示着GRF7参与SHB1介导的光信号转导。(5)将GRF7基因的启动子分成五部分P1-P5,利用pSHB1::SHB1-Myc转基因植物进行ChIP-qPCR分析,结果表明SHB1可以结合到GRF7基因的启动子的P3与P4片段,说明GRF7基因是受SHB1调控的直接靶基因。(6)以野生型Ws为材料,分别用CCA1或LHY内源抗体进行染色质免疫共沉淀分析。ChIP-qPCR分析表明CCA1/LHY可以结合到GRF7基因的启动子的P4片段,说明CCA1/LHY是可以将SHB1招募至GRF7基因启动子区域的蛋白因子。(7)利用qRT-PCR分别在突变体grf7与野生型Col中分析SHB1基因在黑暗与红光3 h、9 h条件下的表达情况,结果表明在红光条件下grf7突变体中SHB1表达下降,说明GRF7在光下可以促进SHB1基因的表达。本实验通过RNA-Seq数据发现SHB1调控GRF7基因的表达,同时,ChIP-qPCR实验证明GRF7是SHB1在响应红光信号过程中的直接靶基因。这一发现首次证明了GRF7基因参与调控植物的光信号转导过程,有助于我们理解SHB1在植物光形态建成中的作用。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

山东农业大学硕士学位论文7图1-1植物幼苗去黄化（Quail,2002）Fig.1-1Thede-etiolationofplantseedlings1.1.1植物光受体自然界中的植物通过不断地进化形成了接收各种波长的光受体。这些光受体能感知到植物周围的光强的变化、光方向的变化以及光周期的变化等，从而进一步响应植物体内的各种变化。光受体在模式植物拟南芥中研究的比较透彻（图1-2），其中主要的光受体有：接收280～315nm紫外光的紫外光受体（UVR8）；接收315～500nm蓝光的隐花色素1和2（CRY1和CRY2）以及向光素（phototropin）；接收600～750nm波长的红光和远红光的光敏色素（PHY）（李秀坤，2019）。在瞬息万变的的光环境下，植物光受体感受到变化后就会开启精确的光信号转导机制去应对不同的光信号，保证自身系统的正常运行。图1-2模式植物拟南芥的光受体（李秀坤，2019）Fig.1-2PhotoreceptorsinArabidopsisthaliana

拟南芥SHB1在红光下调控GRF7基因表达的机制研究12图1-4隐花色素CRY信号转导通路的工作模型（Liuetal.,2011b;Wangetal.,2017）Fig.1-4WorkingmodelsofthesignaltransductionmechanismofArabidopsiscryptochromes研究者在拟南芥突变体nph1中克隆得到向光素（phototropin,PHOT），该突变体是失去向光性的下胚轴突变，没有向光反应，重命名PHOT，编码向光素蛋白（Christieetal.,1999）。向光素与植物的向光生长、叶绿体的运动、叶片的伸展等相关。向光素是一种蛋白激酶，包括PHOT1和PHOT2两个成员，介导植物的向光生长（Christie,2007;Takemiyaetal.,2005）。在向光素的N端有LOV1、LOV2两个保守序列，C端由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成（Hualaetal.,1997;Christieetal.,1999;BriggsandChristie,2002）。PHOT1和PHOT2不存在跨膜结构域，如果对其进行黑暗处理发现会分布在细胞质膜内侧（SakamotoandBriggs,2002;Kongetal.,2006）。若处于蓝光条件下，在细胞质中发现部分PHOT1蛋白（SakamotoandBriggs,2002;Wanetal.,2008），一部分PHOT2蛋白与高尔基体结合在一起（Kongetal.,2006）。PHOT1和PHOT2在拟南芥中的分布并不均匀，PHOT1在根中比较丰富而PHOT2在根中含量较少，拟南芥根的向光性生长主要由PHOT1调控。研究发现蓝光可使向光素分子内的LOV2上的丝氨酸发生自磷酸化，促使向光素激活，从而进一步调控植物光形态的建成（Salomonetal.,2003;Sullivanetal.,2008;Okajimaetal.,2011）。1.1.1.3UVR8在拟南芥中有一组感光体，它们可以感知从UV-B到太阳光谱的远红光部分的整个光谱范围，该感光体包括迄今为止唯一的特定于UV-B的感光受体即UVR8（UVRESISTANCELOCUS8），能够对UVB作出响应（Rizzinietal.,2011）。UVR8的作用是抑制下胚轴伸长，刺激光保护

拟南芥SHB1在红光下调控GRF7基因表达的机制研究14图1-5UVR8介导的信号通路（VanesaEleonoraTossietal.,2019）Figure.1-5UVR8-mediatedsignaltransductionmodel1.1.2光敏色素互作因子研究发现光敏色素经过红光的诱导后，由没有生物活性状态的Pr形式转变成生理活化型的Pfr形式随之进入细胞核，然后与光敏色素互作因子PIFs结合，在细胞核内PIFs被磷酸化与泛素化修饰，随后进入26S蛋白酶体降解途径，促进植物光形态的建成（图1-6）。PIFs属于碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族中的成员，在光信号诱导的植物生长发育过程中起着中心枢纽的作用，在植物的光形态建成、幼苗去黄化、暗形态建成、生物钟、植物的避荫反应中起着重要的调控作用。
【参考文献】

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1 韩瑶瑶;马燕勤;李典珍;徐子勤;;拟南芥Pri-miR156a基因对烟草开花时间的影响[J];基因组学与应用生物学;2015年02期

2 钱珊珊;侯学文;;植物UV-B生理效应的分子机制研究进展[J];植物生理学报;2011年11期

本文编号：2873491