厦门杏林湾海洋真菌次级代谢产物及其生物活性研究

发布时间：2020-11-08 11:46

　　 抗生素的广泛使用使得高水平耐药和多重耐药病原菌大量出现,急需开发有活性的新型化合物。从厦门杏林湾红树林周围采集的海水和植物根际泥样中,共分离得到72株海洋真菌,发酵培养后用乙酸乙酯提取获得粗提物。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌和白色念珠菌为指示菌,对粗提物进行高通量活性筛选,以乙酸乙酯粗提物的最小抑菌浓度作为参考,并结合高效液相(HPLC)指纹图谱分析排重,共筛选出5株次级代谢产物丰富并有抗菌活性的潜力菌株。本研究重点对菌株MF180246和MF180262放大发酵培养,通过减压正向硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱等方法对粗提物分离纯化,综合利用质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)、紫外光谱(UV)、圆二色谱(CD)和比旋光(OR)等方法确定化合物的结构,使用微量稀释法对化合物进行生物活性测试。对菌株MF180246次级代谢产物进行研究,共得到19个化合物,分别为asperbrunneo acid(1)、secalonic acid H(2)、secalonic acid D(3)、secalonic acid F(4)、secalonic acid F1(5)、penicillixanthone A(6)、chrysoxanthone C(7)、asperdichrome(8)、herbarulide(9)、大黄素(10)、tetrahydrofuranlactone derivative(11)、aspergillusol A(12)、3,4-二羟基苯乙酸(13)、4-羟基苯甲醛(14)、2-(4-羟基苯基)-乙醇(15)、vanillic acid(16)、3,4-二羟基苯甲酸(17)、2,5-二羟基苯乙酸甲酯(18)和1-苯基-1,2-乙二醇(19)。化合物1为首次分离得到的新骨架天然产物。对菌株MF180262次级代谢产物进行研究,共得到13个化合物,分别为3-(5-甲氧基羰基戊基)-4-甲基呋喃-2,5-二酮(20)、两种二聚己基衣康酸衍生物(21和22)、5,5'-二甲基-4,4',7,7'-四甲氧基-8,8'-双香豆素(23)、fonsecinone A(24)、asperpyrones B(25)、aurasperone A(26)、asperpyrone C(27)、5,5'-二甲基-7-羟基-4,4',7'-三甲氧基-6,8'-双香豆素(28)、pyrophen(29)、orlandin(30)、aspernigrin A(31)和asperitaconic acid B(32)。化合物20、21和22为新结构化合物,21和22为首次发现的己基衣康酸衍生物的二聚体。通过生物活性筛选试验,发现化合物24、26和27具有抗幽门螺旋杆菌的活性,最小抑菌浓度为16μg/mL。
【学位单位】：中国地质大学(北京)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：Q935
【部分图文】：

技术路线图

中国地质大学（北京）硕士学位论文29柱对馏分O进行分离，合并得到8个组分（O1~O8）。通过分析O1~O8的HPLC指纹图谱，对O5进一步分离纯化。O5用甲醇溶解，过滤除去不溶物用高效液相色谱仪分离纯化。采用AgilentZorbaxRX-C8色谱柱（250×9.4mm，5μm），流速3.0mL/min，乙腈浓度为30%等度洗脱13min得到O5A。O5A用甲醇溶解，用高效液相色谱仪分离纯化。高效液相色谱条件：采用AgilentEclipseXDB-C8色谱柱（150×4.6mm，5μm），流速1.0mL/min，乙腈浓度为10%等度洗脱15min，检测图谱为254nm波长下的色谱图，收集洗脱液减压浓缩得到化合物18和19。O8用甲醇溶解，过滤除去不溶物用高效液相色谱仪分离纯化。高效液相色谱条件：采用AgilentZorbaxRX-C8色谱柱（250×9.4mm，5μm），流速3.0mL/min，乙腈浓度为30%等度洗脱10min和乙腈浓度从30%~60%梯度洗脱5min，检测图谱为254nm波长下的色谱图，收集峰值时间为10.821min的洗脱液，减压浓缩得到化合物12。MF180246的分离流程如图3-1：图3-1MF180246粗提物分离流程3.3.4现代波谱技术纯化的化合物根据其溶解度分别用Acetone-d6、Chloroform-d和DMSO-d6溶解，进行核磁共振测试。核磁共振测试项目包括1HNMR谱、13CNMR谱、COSY谱、HMBC谱、HSQC谱和ROESY谱。综合利用核磁共振（NMR）、质谱（MS）、紫外光谱（UV）、比旋光（OR）和圆二色谱（CD）等现代波谱技术确定化合物的结构。

第三章海洋真菌MF180246次级代谢产物研究303.4实验结果3.4.1菌株信息菌株MF180246是从厦门杏林湾红树林周围植物根际泥样分离得到，其在PDA培养基上28℃培养7天的菌落形态如图3-2所示。菌落生长快，表面呈黑色粉末状，菌落明显凸起于培养基，背面呈黄色，出现典型的曲霉属Aspergillus真菌的菌落特征。图3-2MF180246菌株形态BT测序结果如下：TGGTAAGCTCCAGCCTTTATCCCCTCTCCATCCCCCGTTATGGCTAACCCCCCACCAGGCAGACCATCTCCGGCGAACATGGCCTCGACGGCGACGGCGTGTCAGTGACCCAGCTGGCCCTCGACTCCTTCCCCTTCTGACATCCATCCTAGATACAATGGCACCTCCGACCTCCAGCTGGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACGAAGCCGGCAACAACAAGTACGTGCCCCGCGCGGTGCTGGTTGATCTGGAGCCCGGTACGATGGACGCTCTGCGCTCCGGCCCCATGGGCGGCCTCTTCCGCCCCGACAACTACGTGTTCGGCCAGTCTGGTGCGGGCAACAACTGG得到的BT序列通过NCBI的BLAST系统进行序列比对，选取适量的同源性较高的模式菌株序列，利用MEGA5.1使用邻接法构建系统发育树，步长检验值设为1000，得到菌株MF180246的系统发育树（图3-3）。BLAST结果显示，菌株MF180246与模式菌株AspergillusbrunneoviolaceusCCF108的序列相似性为99.43%，鉴定菌株MF180246为Aspergillusbrunneoviolaceus。
【参考文献】

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本文编号：2874737