钙胁迫下棘孢木霉菌T6对拟南芥促生作用的研究

发布时间：2020-11-22 01:47

【摘要】：钙参与调控有机体内的信号转导和生长发育,是植物生命活动必需的营养元素之一。岩石圈中钙元素含量虽然丰富,但多以CaCO_3等不溶性钙的形式存在,植物无法直接吸收利用,导致作物产量和质量下降,因此,探索解决土壤缺钙及不溶性钙胁迫的方法迫在眉睫。木霉菌(Trichoderma spp.)可以促进植物生长、提高植物抗逆性,是目前备受关注、应用潜力巨大的植物根际益生真菌。本实验室前期研究发现,缺铁条件下棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)Q1可以产生嗜铁素来螯合环境中的不溶性铁以供植物吸收利用,还能够提高拟南芥根部生长素的含量,促进植物生长,但尚未有研究表明钙胁迫下棘孢木霉对植物的促生作用及促生机制。本研究在明确了钙能够影响拟南芥生长的基础上,发现接种棘孢木霉菌T6后可以促进钙胁迫下拟南芥的生长,进而测定了棘孢木霉菌T6在可溶性钙(CaCl_2)和不溶性钙(CaCO_3)条件下的嗜铁素和IAA产量变化,以及CaCl_2、NaCl和pH对T6嗜铁素合成关键基因(SidA)与钙调磷酸酶催化亚基基因(CnA)表达量的影响,初步明确了棘孢木霉菌在钙胁迫下对拟南芥的促生机制以及嗜铁素合成与钙调磷酸酶途径之间的调控关系。具体结果如下:(1)测定了不同浓度的可溶性钙和不溶性钙对拟南芥种子的萌发、拟南芥DR5::GFP转基因型的根长及根部内源性IAA含量的影响。结果表明,钙离子浓度在1 mmol/L~3mmol/L时有利于拟南芥种子萌发、根系生长和根部内源性IAA的产生,钙离子浓度过高和过低以及添加不溶性钙(CaCO_3)时均对植物生长产生抑制作用。(2)为进一步研究钙对拟南芥根部IAA含量的影响,本文首次利用qRT-PCR技术分析了低钙和碳酸钙胁迫对拟南芥根部生长素基因(YUCs)相对表达量的影响,结果表明,钙胁迫抑制了拟南芥根部YUCs基因的表达,该结果与用DR5::GFP转基因型得到内源IAA荧光强度的降低是一致的。(3)利用拟南芥DR5::GFP转基因型研究了在低钙和CaCO_3胁迫下接种棘孢木霉菌T6对拟南芥根长及其根部内源性IAA含量(即荧光强度)的影响,结果显示,接种棘孢木霉T6能促进拟南芥的根长,与对照相比,拟南芥根长分别增加了75.31%(0.5 mmol/LCa~(2+))、55.91%(0.5 g CaCO_3)以及88.94%(1 g CaCO_3),根部内源性IAA含量也显著增加。表明棘孢木霉T6可以通过提高拟南芥体内IAA的含量缓解钙胁迫对植物的危害,促进植物生长。(4)测定了不同钙浓度对棘孢木霉T6的嗜铁素和IAA产量影响,结果表明,低钙及CaCO_3胁迫均可促进T6嗜铁素的产生,最终含量分别提高了9.40%(0.5 mmol/L Ca~(2+))、2.95%(0.5 g CaCO_3)和3.2%(1 g CaCO_3),但对其IAA的产量无显著影响。初步推测钙胁迫对棘孢木霉菌T6嗜铁素的促进可能是其促生机制之一。(5)由于钙调磷酸酶基因的表达与菌体的抗逆能力有关,本文利用半定量PCR技术研究了在NaCl、CaCl_2以及pH等非生物胁迫对棘孢木霉T6 SidA基因与CnA基因表达的影响,以探明胁迫因子对嗜铁素产量的调控关系。结果表明,高浓度氯化钠和高pH胁迫能抑制SidA基因的表达,提高CnA基因的表达;低钙胁迫下SidA基因表达上调,而CnA基因的表达下调,由此表明,SidA基因与CnA基因的表达存在一定的负调控关系。这一发现初步表明,非生物胁迫因子可能是通过钙调磷酸酶途径影响嗜铁素生物合成的,为今后深入探讨棘孢木霉菌T6抗逆境胁迫以及嗜铁素的合成机制提供了一定的参考和借鉴。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2020
【分类号】：Q945.78
【图文】：

山东师范大学硕士学位论文16图2-1CaCl2对拟南芥种子萌发率的影响Fig.2-1EffectsofCaCl2onseedgerminationrateofArabidopsisthaliana2.1.2CaCO3对拟南芥种子萌发率的影响用牙签将消毒后的拟南芥种子种至不同CaCO3处理的1/2MS平板中，春化培养，每24h测量一次发芽率（当胚根通过种皮突出时，种子计为发芽）。由图2-2可知，CaCO3的增加抑制了拟南芥种子的萌发率，且CaCO3含量越高，抑制作用越明显，即拟南芥种子的萌发率与CaCO3含量呈负相关。正常条件下种子萌发率为53.66%，当碳酸钙含量为1g/100mL时，种子萌发率为40.17%，低于空白对照25.14%。

山东师范大学硕士学位论文17图2-2CaCO3对拟南芥种子萌发率的影响Fig.2-2EffectsofCaCO3onseedgerminationrateofArabidopsisthaliana2.2钙离子对拟南芥根长及根部内源性IAA的影响2.2.1钙离子对拟南芥根长影响用牙签将消毒后的拟南芥种子点至1/2MS平板中，待种子萌发并长出两片真叶后，选取长势相同的拟南芥幼苗，移栽至不同处理的培养基中，5d后测量拟南芥根长，结果如图2-3所示，当氯化钙浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、3mmol/L以及5mmol/L时，相比于对照组拟南芥根长分别增加了4.8%、28.92%、25.00%和8.74%。但当氯化钙浓度达到10mmol/L时，对拟南芥生长产生了抑制作用，与空白对照相比，拟南芥根长减少了21.52%。整体来看，当氯化钙浓度为1mmol/L时，拟南芥根长最长，3mmol/L次之。上述结果表明，拟南芥生长的钙离子最适浓度为1mmol/L，钙离子含量过低会产生胁迫作用，抑制拟南芥的生长。

山东师范大学硕士学位论文18图2-3CaCl2对拟南芥根长的影响Fig.2-3EffectsofCaCl2onrootlengthofArabidopsisthaliana2.2.2钙离子对拟南芥DR5::GFP转基因型根部IAA含量的影响选取长势相同的拟南芥幼苗，移栽至不同浓度钙离子的培养基中，5d后在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度，并进行线性和平均荧光强度分析。图2-4为拟南芥根部荧光照片，a-f钙离子浓度依次为0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L。图2-5为图2-4所对应的拟南芥荧光线性扫描图。由图可知，当钙离子浓度为1mmol/L与3mmol/L时，拟南芥根部荧光最亮，即当钙离子浓度为1mmol/L与3mmol/L时拟南芥根部IAA含量最高。钙离子浓度为5mmol/L时次之，其次是0.5mmol/L处理组，而钙离子浓度为10mmol/L时，拟南芥荧光亮度最低，即拟南芥根部的IAA含量最低。综上所述，钙离子浓度为1-3mmol/L时可以促进拟南芥根部IAA的合成，低钙胁迫抑制了拟南芥根部IAA生成，但随着钙离子浓度的增加，拟南芥根部IAA的合成受到抑制。
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本文编号：2893918