马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因在Aureobasidium melanogenum P10菌株中的表达和油脂的生产

发布时间：2017-04-06 18:17

  本文关键词：马克斯克鲁维酵母菊粉酶基因在Aureobasidium melanogenum P10菌株中的表达和油脂的生产，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着化石能源的快速消耗和人们对环境问题的日益重视,研究者逐渐将注意力转移到可再生能源上。生物柴油具有生产周期短、燃烧性能好和可再生等优点,是化石能源的良好替代品。目前,生物柴油工业主要以动植物油脂作为原料进行生物柴油的生产。与动植物油脂相比,利用微生物油脂生产生物柴油具有非常明显的优势。产黑色素短梗霉(A ureobasidium melanogenum)是一类细胞形态类似酵母的真菌。之前的研究发现,A.melanogenum P10菌株(以下简称P10菌株)在特定条件下培养时胞内油脂含量达菌体干重的66.3%。以P10菌株胞内油脂为原料制备的生物柴油燃烧情况良好。分析发现A.melanogenum基因组DNA中没有编码菊粉酶的基因。A.melanogenum菊粉酶活力很低,为了使P10菌株能有效地转化菊粉生产油脂,非常有必要在该菌株高效超表达菊粉酶基因。本研究以潮霉素B抗性基因为标记基因构建了A. melanogenum表达载体pAPX 13。并在P10菌株中成功地表达了马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉酶基因(INUI)。筛选到一株高产菊粉酶的转化子API41(以下简称API41菌株),菊粉酶酶活达到28.5 U/mL,与P10菌株的菊粉酶酶活相比提高了275%。重组菊粉酶最适反应温度为60℃,在温度不高于50℃时保持较高活性；最适反应pH为4.5,在pH 3.0-7.0之间能够保持65%以上活性。在摇瓶中以浓度为8%的菊粉为碳源培养API4l菌株和P10菌株。培养结束后,API41菌株和P10菌株生物量分别为12.92g/L和9.96 g/L;胞内油脂含量分别占菌体干重的59.67%(w/w)和53.71%(w/w)。API41菌株培养液中的总糖残余量为2.1g/L,P10菌株培养液中的总糖残余量为13.4 g/L。以浓度为8%的菊粉为碳源在10-L发酵罐中培养API41菌株生产油脂,发酵结束后,API4l菌株生物量达到14.38g/L,胞内油脂含量为菌体干重的66.20%(w/w),油脂产量是0.12g/g,菌体产量是0.18 g/g, 生产强度是0.001g/g/h。分别将API41菌株和P10菌株生产的油脂进行甲酯化,用气相色谱法分析脂肪酸组成。结果显示,API41菌株和P10菌株胞内油脂成分相同,棕榈酸(C16.0)、亚油酸(C182)和油酸(C18 1)占脂肪酸总量的95%以上。以API41菌株发酵生产的胞内油脂为原料用酸催化法制备生物柴油,在催化反应时问为25 min时生物柴油得率最高,为76.3%。所制备的生物柴油在自然条件下燃烧情况良好,火焰明亮,无黑烟。
【关键词】：产黑色素短梗霉 表达载体 菊粉酶 胞内油脂 生物柴油
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TE667;Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-26
• 1 生物柴油概述12
• 2 生物柴油研究现状12-13
• 3 生物柴油的制备方法13-15
• 3.1 碱催化法13-14
• 3.2 酸催化法14
• 3.3 生物酶催化法14
• 3.4 超临界甲醇法14-15
• 4 微生物油脂15
• 5 产油微生物15-19
• 5.1 产油酵母菌16-17
• 5.2 产油霉菌17-18
• 5.3 产油细菌18
• 5.4 产油微藻18-19
• 6 微生油脂合成途径及调控19-21
• 6.1 微生物油脂合成途径19-20
• 6.2 培养基中氮源含量对油脂合成的调控20-21
• 7 短梗霉(Aureobasidium spp.)简介21-22
• 7.1 短梗霉的形态21
• 7.2 短梗霉的分布和分类21-22
• 7.3 短梗霉的发酵产物22
• 8 菊粉和菊芋22
• 9 菊粉酶22-23
• 10 本论文研究背景和主要研究内容23-26
• 10.1 本论文的研究背景23-24
• 10.2 本论文的主要研究内容24-26
• 第二章 表达载体pAPX13的构建26-44
• 1 前言26-27
• 2 实验材料和方法27-36
• 2.1 菌株和质粒27-28
• 2.2 试剂和培养基28-29
• 2.3 方法29-36
• 3 结果与讨论36-43
• 3.1 潮霉素B敏感性测试结果36-37
• 3.2 A.melanogenum HN6.2菌株基因组DNA的提取37-38
• 3.3 tef1、18S rDNA、26S rDNA和HPT-Poly(A)的克隆38-39
• 3.4 18S-tef1-sp-MCS和tef1-HPT-Poly(A)的克隆39-41
• 3.5 表达，
  
  本文编号：289415
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