抗BoHV-1单克隆抗体制备及gD蛋白抗原表位鉴定
发布时间：2020-12-03 17:23
牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine Infectious Rhinotracheitis Virus,IBRV）又称为是BoHV-1,是牛传染性鼻气管炎（Bovine Infectious Rhinotracheitis,IBR）的病原体,也是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原之一。BoHV-1感染除引起呼吸道炎症外,还可引起结膜炎、流产和神经症状等。此外,BoHV-1具有三叉神经节潜伏感染周期性激活的特点,导致牛传染病鼻气管炎（IBR）清除难度较大,影响养殖业发展。目前国内传统的商品化疫苗具有潜在的风险,所以研制出新型疫苗及抗体诊断制剂,对IBR的防治具有积极的意义。本研究对BoHV-1 Barthanu/67株进行超速离心浓缩作为免疫原,腹腔免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选获得2株单克隆抗体并制备腹水,分别命名为3C1和4F3。亚类鉴定2株单抗重链分别为IgGl和IgA,轻链均为kappa链;间接免疫荧光方法测定上清及腹水效价,单抗3C1效价分别为1:40和1:12 800,单抗4F3效价分别为1:40和1:3200;经间接免疫荧光和Western blot...
【文章来源】： 贾晓雪 黑龙江八一农垦大学
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BoHV-1蛋白结构(EricB,1996)
抗BoHV-1单克隆抗体的制备及鉴定212.2.6.2MAb中和活性的测定DMEM将单抗从1:100倍稀释，连续2倍稀释的3C1细胞培养上清与100个TCID50的BoHV-1病毒混合，于37℃水浴锅作用1h，将混合液每孔100μL接种到96孔板内铺满单层的MDBK细胞上孵育，将只含100个TCID50/100μL病毒混合液直接铺于MDBK细胞内设为阳性对照和并将DMEM培养基不含单抗上清及接种病毒发细胞设为阴性对照照，于48h后观察细胞病变，逐日观察，120h后判定结果，在倒置显微镜下观察细胞病变并作好记录，按Reed–Muench两氏法计算中和效价。2.2.7单克隆抗体的交叉保护分析取本实验室分离并保存保存的以BVDV、BRV、和PRV进行Westernblot分析，将对所获得的单克隆抗体交叉反应进行分析。2.3实验结果及分析2.3.1免疫原的鉴定取经超离浓缩的BoHV-1稀释后与未感染MDBK的细胞培养上清进行SDS-PAGE电泳，以实验室制备出的分离制备的BoHV-1牛阳性血清为一抗，以HRP-IgG标记的兔抗牛抗体为二抗进行Westernblot鉴定。结果显示，BoHV-1牛阳性血清可与超离浓缩的BoHV-1于相对分子质量约55KDa处可见明显特异性结合条带，因抗牛血清为多抗，当能与BoHV-1全病毒有明显反应条带时即可证明我们制备的免疫原反应原性良好。见图2.1。图2.1免疫原的鉴定M：Marker；1：BoHV-1超离浓缩病毒；2：未感染BoHV-1的MDBK细胞Fig.2.1.Identificationofimmunogen1:BoHV-1ultra-isolatedvirus;2:MDBKcellsnotinfectedwithBoHV-1
抗BoHV-1单克隆抗体制备及gD蛋白抗原表位鉴定222.3.2单克隆抗体的制备2.3.2.1杂交瘤细胞的融合细胞融合后，融合后7-10天时，镜下观察，可见明显的细胞团见图2.2。图2.2融合细胞团Fig.2.2FusionCellCluster2.3.2.2杂交瘤细胞株的筛选筛选到的阳性杂交瘤细胞孔内有且仅有一个细胞团时，经6次亚克隆，通过IFA筛选最终获得阳性杂交瘤细胞2株单克隆抗体，分别命名为3C1、4F3。见图2.3。图2.3单克隆抗体的荧光分析（200μm）A：单克隆抗体3C1；B：单克隆抗体4F3；C：BoHV-1未感染的MDBK细胞Fig.2.3Fluorescenceanalysisofmonoclonalantibodies(200μm)A:Monoclonalantibody3C1;B:Monoclonalantibody4F3;C:BoHV-1uninfectedMDBKcells2.3.3单克隆抗体的生物学特性分析2.3.3.1亚类鉴定单克隆抗体3C1、4F3根据Biodragon小鼠单抗亚类鉴定的试剂盒说明书操作进行亚类和轻链进行了鉴定，结果显示3C1重链为IgG1亚类，轻链为Kappa链;4F3为IgA亚类，轻链为Kappa链。如图2.4所示。图2.4单克隆抗体的亚类鉴定Fig.2.4Identificationofsubclassesofmonoclonalantibodies
【参考文献】：
期刊论文
[1]河北省奶牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与系统进化分析[J]. 陈颖彬,常丽云,李林,王紫燕,赵越,康茜,赵月兰,秦建华. 黑龙江畜牧兽医. 2019(13)
[2]牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立[J]. 张颖慧,岳华,汤承,黄建德. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[3]牛传染性鼻气管炎疫苗研究进展[J]. 刘瑞宁,邓明亮,刘玉辉,陈颖钰,郭爱珍. 动物医学进展. 2016(02)
[4]牛传染性鼻气管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 孙志明,周伟光,陈玉惠,高晶,希尼尼根,关平原. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2012(03)
[5]牦牛病毒性腹泻/黏膜病和传染性鼻气管炎血清学调查[J]. 韩志辉,圈华,贺晓龙,魏科峰,额尔德尼扎布. 中国动物传染病学报. 2010(06)
[6]牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 唐泰山,邓碧华,王凯民,张常印,雷治海. 动物医学进展. 2009(04)
[7]牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立[J]. 邓碧华,王凯民,唐泰山,张常印,雷治海. 中国兽医学报. 2008(06)
[8]牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白的表达及gG-ELISA的建立[J]. 颜邦芬,陈锃,张书环,林祥梅,陈颖钰,晁彦杰,李德学,宋念华,陈焕春,郭爱珍. 生物工程学报. 2007(05)
[9]利用巢式PCR快速鉴定牛传染性鼻气管炎[J]. 杨少华,王长法,高运东,刘文浩,李彦芹,仲跻峰. 家畜生态学报. 2007(04)
[10]牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立[J]. 李兆利,薛飞,朱远茂,王延辉. 畜牧兽医学报. 2006(12)
博士论文
[1]鸡传染性支气管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 邹年莉.四川农业大学 2015
硕士论文
[1]牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立[D]. 向文杰.中国农业科学院 2019
[2]美洲型PRRSV GP4蛋白中和单抗的制备及其抗原表位鉴定[D]. 刘梦莹.福建农林大学 2019
[3]猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体制备及B细胞线性表位鉴定[D]. 赵微.黑龙江八一农垦大学 2018
[4]牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA的建立[D]. 周跃辉.中国农业科学院 2015
[5]牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其单克隆抗体制备[D]. 王延涛.黑龙江八一农垦大学 2008
本文编号：2896456
【文章来源】： 贾晓雪 黑龙江八一农垦大学
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BoHV-1蛋白结构(EricB,1996)
抗BoHV-1单克隆抗体的制备及鉴定212.2.6.2MAb中和活性的测定DMEM将单抗从1:100倍稀释，连续2倍稀释的3C1细胞培养上清与100个TCID50的BoHV-1病毒混合，于37℃水浴锅作用1h，将混合液每孔100μL接种到96孔板内铺满单层的MDBK细胞上孵育，将只含100个TCID50/100μL病毒混合液直接铺于MDBK细胞内设为阳性对照和并将DMEM培养基不含单抗上清及接种病毒发细胞设为阴性对照照，于48h后观察细胞病变，逐日观察，120h后判定结果，在倒置显微镜下观察细胞病变并作好记录，按Reed–Muench两氏法计算中和效价。2.2.7单克隆抗体的交叉保护分析取本实验室分离并保存保存的以BVDV、BRV、和PRV进行Westernblot分析，将对所获得的单克隆抗体交叉反应进行分析。2.3实验结果及分析2.3.1免疫原的鉴定取经超离浓缩的BoHV-1稀释后与未感染MDBK的细胞培养上清进行SDS-PAGE电泳，以实验室制备出的分离制备的BoHV-1牛阳性血清为一抗，以HRP-IgG标记的兔抗牛抗体为二抗进行Westernblot鉴定。结果显示，BoHV-1牛阳性血清可与超离浓缩的BoHV-1于相对分子质量约55KDa处可见明显特异性结合条带，因抗牛血清为多抗，当能与BoHV-1全病毒有明显反应条带时即可证明我们制备的免疫原反应原性良好。见图2.1。图2.1免疫原的鉴定M：Marker；1：BoHV-1超离浓缩病毒；2：未感染BoHV-1的MDBK细胞Fig.2.1.Identificationofimmunogen1:BoHV-1ultra-isolatedvirus;2:MDBKcellsnotinfectedwithBoHV-1
抗BoHV-1单克隆抗体制备及gD蛋白抗原表位鉴定222.3.2单克隆抗体的制备2.3.2.1杂交瘤细胞的融合细胞融合后，融合后7-10天时，镜下观察，可见明显的细胞团见图2.2。图2.2融合细胞团Fig.2.2FusionCellCluster2.3.2.2杂交瘤细胞株的筛选筛选到的阳性杂交瘤细胞孔内有且仅有一个细胞团时，经6次亚克隆，通过IFA筛选最终获得阳性杂交瘤细胞2株单克隆抗体，分别命名为3C1、4F3。见图2.3。图2.3单克隆抗体的荧光分析（200μm）A：单克隆抗体3C1；B：单克隆抗体4F3；C：BoHV-1未感染的MDBK细胞Fig.2.3Fluorescenceanalysisofmonoclonalantibodies(200μm)A:Monoclonalantibody3C1;B:Monoclonalantibody4F3;C:BoHV-1uninfectedMDBKcells2.3.3单克隆抗体的生物学特性分析2.3.3.1亚类鉴定单克隆抗体3C1、4F3根据Biodragon小鼠单抗亚类鉴定的试剂盒说明书操作进行亚类和轻链进行了鉴定，结果显示3C1重链为IgG1亚类，轻链为Kappa链;4F3为IgA亚类，轻链为Kappa链。如图2.4所示。图2.4单克隆抗体的亚类鉴定Fig.2.4Identificationofsubclassesofmonoclonalantibodies
【参考文献】：
期刊论文
[1]河北省奶牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与系统进化分析[J]. 陈颖彬,常丽云,李林,王紫燕,赵越,康茜,赵月兰,秦建华. 黑龙江畜牧兽医. 2019(13)
[2]牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立[J]. 张颖慧,岳华,汤承,黄建德. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[3]牛传染性鼻气管炎疫苗研究进展[J]. 刘瑞宁,邓明亮,刘玉辉,陈颖钰,郭爱珍. 动物医学进展. 2016(02)
[4]牛传染性鼻气管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 孙志明,周伟光,陈玉惠,高晶,希尼尼根,关平原. 内蒙古农业大学学报(自然科学版). 2012(03)
[5]牦牛病毒性腹泻/黏膜病和传染性鼻气管炎血清学调查[J]. 韩志辉,圈华,贺晓龙,魏科峰,额尔德尼扎布. 中国动物传染病学报. 2010(06)
[6]牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 唐泰山,邓碧华,王凯民,张常印,雷治海. 动物医学进展. 2009(04)
[7]牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立[J]. 邓碧华,王凯民,唐泰山,张常印,雷治海. 中国兽医学报. 2008(06)
[8]牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白的表达及gG-ELISA的建立[J]. 颜邦芬,陈锃,张书环,林祥梅,陈颖钰,晁彦杰,李德学,宋念华,陈焕春,郭爱珍. 生物工程学报. 2007(05)
[9]利用巢式PCR快速鉴定牛传染性鼻气管炎[J]. 杨少华,王长法,高运东,刘文浩,李彦芹,仲跻峰. 家畜生态学报. 2007(04)
[10]牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立[J]. 李兆利,薛飞,朱远茂,王延辉. 畜牧兽医学报. 2006(12)
博士论文
[1]鸡传染性支气管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 邹年莉.四川农业大学 2015
硕士论文
[1]牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立[D]. 向文杰.中国农业科学院 2019
[2]美洲型PRRSV GP4蛋白中和单抗的制备及其抗原表位鉴定[D]. 刘梦莹.福建农林大学 2019
[3]猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体制备及B细胞线性表位鉴定[D]. 赵微.黑龙江八一农垦大学 2018
[4]牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA的建立[D]. 周跃辉.中国农业科学院 2015
[5]牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其单克隆抗体制备[D]. 王延涛.黑龙江八一农垦大学 2008
本文编号：2896456
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