嗜热子囊菌热稳定多糖单加氧酶的基因克

发布时间：2020-12-09 11:36

　　木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）是一类可在高温环境中生存的真菌,在40⁵0℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶（Polysaccharide monooxygenases,PMOs）是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子（如维生素C）存在下可使纤维素分子氧化降解。本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 纤维素酶概况
        1.1.1 纤维素酶组成
        1.1.2 纤维素酶的酶促水解
    1.2 多糖单加氧酶（PMO）简述
        1.2.1 多糖单加氧酶（PMO）的研究过程
        1.2.2 多糖单加氧酶（PMO）的分类机制
        1.2.3 多糖单加氧酶（PMO）的结构与功能
        1.2.4 多糖单加氧酶（PMO）的协同作用
    1.3 嗜热真菌的研究现状
        1.3.1 嗜热真菌研究意义
        1.3.2 嗜热真菌的分子生物学应用
    1.4 嗜热子囊菌PMO的获得及应用
        1.4.1 嗜热子囊菌PMO基因的筛选与获得
        1.4.2 嗜热子囊菌PMO酵母工程菌的构建
        1.4.3 嗜热子囊菌PMO异源表达最适条件研究
        1.4.4 嗜热子囊菌PMO酶解效率研究
        1.4.5 嗜热真菌PMO酶制剂的应用分析
    1.5 选题意义以及研究内容
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 研究内容
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 实验试剂盒
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 数据处理软件
        2.1.5 培养基的制备
        2.1.6 溶液的制备
    2.2 嗜热子囊菌PMO片段的克隆及其序列分析
        2.2.1 嗜热子囊菌DNA的提取
        2.2.2 DNA样品检测
        2.2.3 扩增PMOs基因
            2.2.3.1 PCR引物设计
            2.2.3.2 PCR扩增
            2.2.3.3 PCR产物胶回收
        2.2.4 克隆载体的连接转化
        2.2.5 重组质粒的DNA提取
    2.3 PMOs基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化
        2.3.1 表达载体pPICZαA的构建
        2.3.2 质粒的线性化及去磷酸化
        2.3.3 酵母转化（电击法）
            2.3.3.1 P.pastoris GS115感受态细胞的制备
            2.3.3.2 重组表达质粒pPICZαA-PMO的电击转化
        2.3.4 二次筛选并鉴定酵母阳性转化子
        2.3.5 重组表达质粒工程菌的培养以及多糖单加氧酶的诱导表达
        2.3.6 重组多糖单加氧酶的分离与纯化
            2.3.6.1 硫酸铵沉淀
            2.3.6.2 HisTrapTM FF镍柱亲和层析
        2.3.7 蛋白质分子量及其纯度鉴定
            2.3.7.1 蛋白质浓度测定
            2.3.7.2 蛋白质纯度测定
            2.3.7.3 多糖单加氧酶氨基酸序列分析
    2.4 PMOs蛋白的酶学特性研究
        2.4.1 PMO的最适反应温度
        2.4.2 PMO的最适反应pH值
        2.4.3 PMO蛋白与纤维素酶的协同作用
    2.5 多糖单加氧酶产物的TLC分析
        2.5.1 薄层层析法（TLC）分析产物
        2.5.2 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（TOF）分析
3 结果与分析
    3.1 嗜热子囊菌PMO蛋白的序列分析及片段克隆
        3.1.1 嗜热子囊菌两个PMOs的序列分析
        3.1.2 嗜热子囊菌PMO基因的扩增与鉴定
    3.2 PMOs基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化
        3.2.1 表达载体pPICZαA-PMO的构建
        3.2.2 表达载体pPICZαA-PMOs的克隆
        3.2.3 表达载体pPICZαA-PMOs的酵母转化以及抗性筛选
        3.2.4 鉴定酵母阳性转化子
        3.2.5 重组多糖单加氧酶的表达
        3.2.6 重组多糖单加氧酶的纯化
        3.2.7 重组多糖单加氧酶的分子量及纯度测定
    3.3 嗜热子囊菌PMOs的性质研究
        3.3.1 PMOs的TLC产物分析
        3.3.2 最适反应温度
        3.3.3 PMO的最适反应pH值
        3.3.4 PMO的飞行时间质谱分析
        3.3.5 PMO的协同作用分析
4 讨论
    4.1 嗜热子囊菌PMO蛋白的序列分析及片段克隆
        4.1.1 嗜热子囊菌两个PMOs的序列分析
        4.1.2 嗜热子囊菌PMOs基因的表达载体构建
        4.1.3 嗜热子囊菌重组PMO的异源表达
            4.1.3.1 重组质粒的线性化
            4.1.3.2 重组质粒的高效异源表达
    4.2 嗜热子囊菌重组PMO的性质探究
        4.2.1 嗜热子囊菌重组PMO的氧化裂解性
        4.2.2 嗜热子囊菌重组PMO的酶促活性
5 结论
    5.1 嗜热子囊菌PMO的克隆表达以及分离纯化
    5.2 多糖单加氧酶酶解产物及协同作用分析
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展[J]. 闵兆升,郭会明,颜旭,洪厚胜.  生物技术通报. 2014(03)
[2]纤维素酶的分子生物学与基因工程研究进展[J]. 刘燕,张宏福,孙哲.  饲料工业. 2007(18)
[3]巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统[J]. 李健仔.  生物学通报. 2005(03)
[4]嗜热真菌M5的生物学特性[J]. 姜成,庞俊成,郑渊明,王泽生.  中国食用菌. 1996(04)
[5]生物增温发酵剂中TM1产生的几种酶的特点[J]. 凌霞芬,冯志勇.  食用菌. 1994(03)



本文编号：2906799