骨细胞Smad4通过Notch信号调控成骨分化的机制研究
发布时间：2020-12-09 13:03
目的:本研究选择Notch信号配体Delta-like基因,建立稳定表达外源Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株,研究骨细胞Notch信号Delta-like类配体Dll1、Dll3及Dll4对骨髓基质细胞（Bone marrow Stromal cell,BMSC）成骨分化的影响,明确Notch信号Delta-like配体是否具有促成骨作用,以揭示骨细胞Smad4促进骨形成的分子机制。方法:（1）采用基因克隆技术制备慢病毒过表达Dll1、Dll3及Dll4基因的载体,将三个目的基因分别克隆至慢病毒过表达载体pLent-GFP-PURO-cmv（Flag）。（2）将慢病毒过表达载体与慢病毒包装系统质粒（psPAX2、pMD2.G）共转染293T细胞,获得的慢病毒原液感染MLO-Y4样骨细胞,嘌呤霉素筛选分别稳定表达Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4样骨细胞。并采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,QPCR）对筛选出来的MLO-Y4样骨细胞中Dll1、Dll3及Dll4基因的表达进行鉴定。（3）将三种稳定表达Delta...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Delta-like基因重组慢病毒过表达载体电泳结果
重庆医科大学硕士研究生学位论文33图3.2Delta-like基因重组慢病毒过表达载体测序结果。（A）、（B）和（C）分别为pLent-GFP-Dll1、Dll3及Dll4部分测序峰图。注：（A）：pLent-GFP-Dll1；（B）：pLent-GFP-Dll3；（C）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.2ThesequencingresultsforrecombinantlentivirusoverexpressionvectorofDelta-likegenes.(A),(B)and(C)arepartialsequencingpeaksofpLent-GFP-Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-Dll1;(B):pLent-GFP-Dll3;(C):pLent-GFP-Dll43.2Delta-like重组慢病毒过表达质粒的包装及滴度测定采用三质粒包装系统将重组慢病毒过表达质粒与包装质粒（psPAX2、pMD2.G）共同转染293T细胞，24h后在荧光显微镜下观察GFP表达。转染后48h均出现绿色荧光，说明重组慢病毒质粒包装成功（图3.3）。48h和96h左右收集病毒上清液并浓缩，测得Dll1、Dll3及Dll4慢病毒过表达质粒离心浓缩后的滴度分别为1×107、3×107、3×107pfu/mL，对照质粒达到2×108pfu/mL。
重庆医科大学硕士研究生学位论文35图3.4不同MOI值的重组过表达慢病毒转染MLO-Y4细胞的效率（100×）。Dll1、Dll3、Dll4及对照质粒慢病毒分别以20、60、100、120的MOI值转染MLO-Y4细胞，72h后在荧光显微镜下观察到GFP在细胞中表达。（A）、（B）、（C）和（D）分别为pLent-GFP-control、Dll1、Dll3及Dll4。注：（A）：pLent-GFP-control；（B）：pLent-GFP-Dll1；（C）：pLent-GFP-Dll3；（D）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.4TheefficiencyofrecombinantoverexpressionlentivirustransfectingMLO-Y4cellswithdifferentMOIvalues(100×).ThelentivirusesofDll1,Dll3,Dll4andcontrolplasmidsweretransfectedintoMLO-Y4cellswithMOIvaluesof20,60,100,120andGFPwasobservedinthesecellsunderafluorescencemicroscope72hourslater.(A),(B),(C)and(D)arepLent-GFP-control,Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-control;(B):pLent-GFP-Dll1;(C):pLent-GFP-Dll3;(D):pLent-GFP-Dll4选择MOI值为120的慢病毒转染接种于六孔板的MLO-Y4细胞，72h后观察到绿色荧光。3个目的基因过表达慢病毒及对照慢病毒的转染率均在80%以上（图3.5）。用含嘌呤霉素的完全培养基筛选10d后获得了稳定转染的阳性MLO-Y4细胞。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Smad4促进成骨分化的机制研究[J]. 刘俊银,冯玮,涂小林. 中国骨质疏松杂志. 2019(05)
本文编号：2906904
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Delta-like基因重组慢病毒过表达载体电泳结果
重庆医科大学硕士研究生学位论文33图3.2Delta-like基因重组慢病毒过表达载体测序结果。（A）、（B）和（C）分别为pLent-GFP-Dll1、Dll3及Dll4部分测序峰图。注：（A）：pLent-GFP-Dll1；（B）：pLent-GFP-Dll3；（C）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.2ThesequencingresultsforrecombinantlentivirusoverexpressionvectorofDelta-likegenes.(A),(B)and(C)arepartialsequencingpeaksofpLent-GFP-Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-Dll1;(B):pLent-GFP-Dll3;(C):pLent-GFP-Dll43.2Delta-like重组慢病毒过表达质粒的包装及滴度测定采用三质粒包装系统将重组慢病毒过表达质粒与包装质粒（psPAX2、pMD2.G）共同转染293T细胞，24h后在荧光显微镜下观察GFP表达。转染后48h均出现绿色荧光，说明重组慢病毒质粒包装成功（图3.3）。48h和96h左右收集病毒上清液并浓缩，测得Dll1、Dll3及Dll4慢病毒过表达质粒离心浓缩后的滴度分别为1×107、3×107、3×107pfu/mL，对照质粒达到2×108pfu/mL。
重庆医科大学硕士研究生学位论文35图3.4不同MOI值的重组过表达慢病毒转染MLO-Y4细胞的效率（100×）。Dll1、Dll3、Dll4及对照质粒慢病毒分别以20、60、100、120的MOI值转染MLO-Y4细胞，72h后在荧光显微镜下观察到GFP在细胞中表达。（A）、（B）、（C）和（D）分别为pLent-GFP-control、Dll1、Dll3及Dll4。注：（A）：pLent-GFP-control；（B）：pLent-GFP-Dll1；（C）：pLent-GFP-Dll3；（D）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.4TheefficiencyofrecombinantoverexpressionlentivirustransfectingMLO-Y4cellswithdifferentMOIvalues(100×).ThelentivirusesofDll1,Dll3,Dll4andcontrolplasmidsweretransfectedintoMLO-Y4cellswithMOIvaluesof20,60,100,120andGFPwasobservedinthesecellsunderafluorescencemicroscope72hourslater.(A),(B),(C)and(D)arepLent-GFP-control,Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-control;(B):pLent-GFP-Dll1;(C):pLent-GFP-Dll3;(D):pLent-GFP-Dll4选择MOI值为120的慢病毒转染接种于六孔板的MLO-Y4细胞，72h后观察到绿色荧光。3个目的基因过表达慢病毒及对照慢病毒的转染率均在80%以上（图3.5）。用含嘌呤霉素的完全培养基筛选10d后获得了稳定转染的阳性MLO-Y4细胞。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Smad4促进成骨分化的机制研究[J]. 刘俊银,冯玮,涂小林. 中国骨质疏松杂志. 2019(05)
本文编号：2906904
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