无标记CRISPR/Cas9技术编辑MSTN基因蒙古牛细胞株的建立

发布时间：2020-12-27 14:49

　　肌肉生长抑制素基因（Myostatin）是TGF-β家族中的一员,是一种分泌型糖蛋白。是可负调控肌肉生长发育的一种因子,主要在哺乳动物的骨骼肌中特异性表达。最近研究发现,该基因的过表达可以导致动物的肌肉萎缩,而该基因的突变会使基因功能失活,从而引起动物肌肉纤维数和直径增加,出现明显的"双肌"性状。蒙古牛作为内蒙古地区高原特色物种,存在产肉率低等问题,所以,培育出性状优良、产肉率高的蒙古牛对于内蒙古地区的种质资源保护及优化、遗传育种、经济增长等具有重要意义。同时对于医学研究利用基因编辑技术治疗与肌肉生长发育相关的疾病也具有重要意义。本研究的目的是设计并建立一个安全且无任何筛选标记编辑MSTN的CRISPR/Cas9载体;同时通过组织块贴壁法对妊娠45天的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系。实验中,根据蒙古牛的MSTW第二外显子基因序列,设计并构建了 3个无标记CRISPR/Cas9载体,分别为:C1,C2,C3,经测序和体内活性检测,载体C1构建正确且具有生物活性,可用于后续细胞转染实验。通过电转染方法将构建好的载体C1转染到蒙古牛胎儿成纤维细胞中,通过无限稀释法和口吸管法接种单细胞,扩繁后... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
    1.1 肌肉生长抑制素基因的研究进展
        1.1.1 MSTN的发现
        1.1.2 MSTN的结构
        1.1.3 MSTN的特异性
        1.1.4 MSTN的生物学功能
        1.1.5 MSTN的应用与前景
    1.2 人工核酸酶基因靶向编辑技术的发展
        1.2.1 锌指核酸酶技术
        1.2.2 类转录激活因子样效应物核酸酶技术
        1.2.3 CRISPR/Cas9技术
        1.2.4 NgAgo-gDNA技术
    1.3 转基因生物安全性
    1.4 本文研究的目的和意义
2 编辑蒙古牛MSTN基因CRISPR/Cas9载体的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 实验试剂及耗材
        2.1.3 实验主要试剂配制方法
    2.2 实验内容与方法
        2.2.1 编辑蒙古牛MSTN基因CRISPR/Cas9载体的构建
        2.2.2 载体的活性检测
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 CRISPR/Cas9质粒图谱
        2.3.2 细胞基因组PCR结果
        2.3.3 载体活性检测结果
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞系的建立
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验仪器
        3.1.2 实验试剂及耗材
        3.1.3 实验主要试剂配制方法
    3.2 实验内容与方法
        3.2.1 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞原代培养
        3.2.2 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞传代培养
        3.2.3 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞冻存和复苏
        3.2.4 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞生长曲线的测定
        3.2.5 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞的染色体数目分析
        3.2.6 蒙古牛胎儿的性别鉴定
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞原代培养
        3.3.2 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞传代培养
        3.3.3 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞生长曲线的测定
        3.3.4 蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞的染色体数目分析
        3.3.5 蒙古牛胎儿的性别鉴定
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 无标记编辑蒙古牛MSTN基因成纤维细胞株的建立
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验仪器
        4.1.2 实验试剂及耗材
        4.1.3 实验主要试剂配制方法
    4.2 实验内容与方法
        4.2.1 细胞转染条件摸索
        4.2.2 无标记编辑蒙古牛MSTN基因成纤维细胞株的建立
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 细胞转染条件摸索
        4.3.2 CRISPR/Cas9载体与成纤维细胞共转染结果
        4.3.3 单细胞培养结果
        4.3.4 单细胞株鉴定结果
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 总体结论
致谢
参考文献
附录
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]新一代基因组编辑技术——NgAgo-gDNA[J]. 杨洁,曹玉锦.  生物学教学. 2016(11)
[2]CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用[J]. 王玮玮,刘瑞琪,吴勇延,杨严格,王勇胜,卿素珠.  畜牧兽医学报. 2016(07)
[3]肌肉生长抑制素对骨骼肌作用研究进展[J]. 杨惠,额尔敦木图,姜建强,包花尔,那仁巴图,刘图雅.  动物医学进展. 2016(05)
[4]CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用[J]. 幸宇云,杨强,任军.  遗传. 2016(03)
[5]TALEN技术研究进展[J]. 严爱芬,刘婉霞,刘芳,唐冬生.  广东农业科学. 2015(23)
[6]基因组靶向修饰技术研究进展[J]. 周阳,袁少飞,蒋廷亚,韩邦兴,高力,陈乃富.  生物学杂志. 2015(05)
[7]肌肉生长抑制素基因(MSTN)的研究进展[J]. 乌日罕,付艳茹,格日勒图.  畜牧与饲料科学. 2015(08)
[8]MSTN在动物育种中的应用研究进展[J]. 杜玮,夏俊,李红波,李娜,闫向民,周振勇,张杨,谢伍忠.  现代农业科技. 2015(11)
[9]CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索[J]. 肖利佳,龙寿斌,罗历,沈化清,郝建华.  海南医学. 2015(01)
[10]CRISPR-Cas系统在生物学研究中的应用[J]. 康峰,卢胜明,张海峰.  实验动物科学. 2014(04)



本文编号：2941936