细胞膜阳离子结合蛋白调控马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒侵染的分子机制
发布时间：2021-01-06 10:37
植物病毒通过编码的移动蛋白（Movement protein,MP）与寄主蛋白相互作用完成移动和系统侵染。通过分析与MP互作的寄主蛋白在病毒移动和致病过程中的作用,可发现新的抗病毒靶标,提出可持续治理植物病毒病的新策略。P3NPIPO是马铃薯Y病毒属病毒的移动蛋白,但是与P3N-PIPO互作的寄主因子相关研究较少。本研究筛选到了马铃薯中与P3N-PIPO互作的细胞膜阳离子结合蛋白（PLASMA-MEMBRANE ASSOCIATED CATION-BINDING PROTEIN 1,PCaP1）。通过沉默和过表达研究发现,PCaP1的存在会促进马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒的细胞间移动。通过免疫共沉淀和体外Pull-Down验证了PCaP1与P3N-PIPO互作,并鉴定到二者互作的关键区域。结果如下:（1）筛选到马铃薯中与P3N-PIPO互作的寄主蛋白StPCaP1,该互作关系在番茄、马铃薯和普通烟中普遍存在。以TVBMV-P3N-PIPO为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选马铃薯cDNA文库。分析共鉴定出包含PCaP1在内的6个可能与TVBMV-P3N-PIPO进行相互作用的寄主蛋白。...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
马铃薯Y病毒属病毒基因组结构示意图
细胞膜阳离子结合蛋白调控马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒侵染的分子机制图1-2马铃薯Y病毒科病毒PIPO基因序列比对(Chung等,2008)Fig.1-2PIPOgenesequencecomparisonofPotyviridaevirus(Chungetal.,2008)1.3.2P3N-PIPO参与植物病毒的侵染1.3.2.1P3N-PIPO的亚细胞定位Wei等在2010年研究了P3N-PIPO的亚细胞定位（Wei等,2010）。通过农杆菌浸润的方式于本氏烟中过表达P3N-PIPO-GFP融合蛋白，发现P3N-PIPO-GFP融合蛋白定位于细胞壁上，呈点状结构，并且能与胞间连丝定位MarkerPDLP1-mRFP共定位，证明P3N-PIPO定位于胞间连丝。1.3.2.2P3N-PIPO促进自身的细胞间移动在没有病毒RNA的情况下，许多移动蛋白可以在细胞间移动。2012年，Vijayapalani等测试了P3N-PIPO在细胞间移动中的能力。构建了P3N-PIPO-GFP表达载体(Vijayapalani等,2012)。该构建体在推定的移码位点（GGAAAAAA）插入一个核苷酸，以表达P3N-PIPO而不移码。用编码GFP或P3N-PIPO-GFP的质粒分别注射本氏烟草叶片。用单独编码GFP的质粒接种（hpb）48小时后，绿色荧光被限制在单个细胞中，并且从未扩散到相邻细胞中。P3N-PIPO-GFP在24hpb处以点状夹杂物的形式聚集在细胞周围，到48hpb时，不仅观察到P3N-PIPO-GFP的运动，还有4–5个细胞的荧光细胞，表明存在明显的细胞间移动。因此，正如其他病毒MP一样，P3N-PIPO-GFP的P3N-PIPO部分允许蛋白质移动到相邻细胞。1.3.2.3P3N-PIPO与寄主蛋白互作鉴定互作的寄主蛋白是了解P3N-PIPO在马铃薯Y病毒属病毒侵染中功能的有力证据。Wei等证明P3N-PIPO定位于胞间连丝，可以在植物体内与CI互作，二者以特定比例形成复合体，调控胞间连丝相关结构的形成和病毒的移动(Wei等,2010;Carrington,2010)。
山东农业大学硕士学位论文9Vijayapalan等使用酵母双杂交筛选到与TuMV的P3N-PIPO相互作用的阳离子结合蛋白PCaP1。在植物中验证了P3N-PIPO和PCaP1相互作用的特异性，其中发现P3N-PIPO与PCaP1共定位在质膜和质膜中(Vijayapalan等,2012)。2015年，Geng等发现番茄和本式烟中受发育调控的质膜蛋白（Developmentallyregulatedplasmamembraneprotein，DREPP）同时与P3N-PIPO和CI两种移动蛋白互作，一起调控TVBMV细胞间移动(Geng等,2015)。Geng等研究发现，P3N-PIPO的长度是可变的，只有满足长度要求的P3N-PIPO才可以介导病毒的移动。寄主蛋白NbDREPP定位在细胞壁，与P3N-PIPO和CI相互作用，它们都是马铃薯Y病毒运动复合体的基本组成部分。寄主蛋白NbDREPP通过依赖COPI和COPII的早期分泌途径流向细胞壁。沉默DREPP基因可阻碍TVBMV在本式烟和番茄中的移动。图1-3TVBMV细胞间移动模型（Geng等,2015）Figure1-3Themodelofcell-to-cellmovementofTVBMV(Gengetal.,2015)1.3.2.4P3N-PIPO参与病毒的协生作用不同植物病毒侵染寄主后可能出现协生现象。在普通烟（Nicotianatabacum）中，马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒（PVY）会产生协生作用，使症状严重性急剧增加，PVXRNA复制调控发生改变以及PVX病毒含量增加。但是这种协生作用在不同的寄主上表现不同。在本氏烟中，当PVX与PVY、TEV共同侵染时，虽然能够引起植株的症状严重，并且产生系统性坏死，但是PVX病毒积累量并没有显著上升(González-Jara等,2005)。三叶草黄脉病毒（ClYVV）和白三叶草花叶病毒（WClMV）混合感染豌豆（Pisumsativum）导致更为严重的疾病症状(Choi等,2013)。与混合的ClYVV/WClMV感染相似，基于WClMV的载体编码ClYVV的P3N-PIPO加剧了疾病症状。用编码ClYVV
【参考文献】：
期刊论文
[1]马铃薯Y病毒siRNA介导抗病基因工程研究进展[J]. 张威,白艳菊,范国权,高艳玲,申宇,张抒,郭炜,孟宪欣. 中国农学通报. 2014(09)
[2]马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化[J]. 杨炳辉,高亦兵. 检验检疫学刊. 2014(01)
[3]长乐市马铃薯病毒病流行原因与防治技术[J]. 邹雪玉. 福建农业科技. 2013(09)
[4]中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 高芳銮,沈建国,史凤阳,方治国,谢联辉,詹家绥. 中国农业科学. 2013(15)
[5]马铃薯Y病毒病的检测技术及防治策略[J]. 贾霁,肖启明,刘剑峰,周志成,刘双清,唐前君. 园艺与种苗. 2013(01)
[6]湖南省马铃薯主产区马铃薯病毒种类及流行分析[J]. 胡新喜,雷艳,何长征,刘明月,李炎林,宋勇,黄科,秦玉芝,熊兴耀,Nie Xianzhou. 中国马铃薯. 2012(06)
[7]蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4,5二磷酸之间相互调节作用的研究进展[J]. 陈兴娟,张熙东,张璇,杲海霞,张海林. 中国药理学通报. 2012(11)
[8]马铃薯Y病毒研究进展[J]. 胡新喜,何长征,熊兴耀,刘明月,宋勇,聂先舟. 中国马铃薯. 2009(05)
[9]番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究[J]. 张余洋,漆梅芳,叶志彪,李汉霞. 自然科学进展. 2008(05)
博士论文
[1]烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC-Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制[D]. 王洁.山东农业大学 2012
硕士论文
[1]病毒基因组连接蛋白影响烟草脉带花叶病毒致病性的机制[D]. 牟安丽.山东农业大学 2013
[2]芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析[D]. 王红艳.山东农业大学 2008
本文编号：2960420
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
马铃薯Y病毒属病毒基因组结构示意图
细胞膜阳离子结合蛋白调控马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒侵染的分子机制图1-2马铃薯Y病毒科病毒PIPO基因序列比对(Chung等,2008)Fig.1-2PIPOgenesequencecomparisonofPotyviridaevirus(Chungetal.,2008)1.3.2P3N-PIPO参与植物病毒的侵染1.3.2.1P3N-PIPO的亚细胞定位Wei等在2010年研究了P3N-PIPO的亚细胞定位（Wei等,2010）。通过农杆菌浸润的方式于本氏烟中过表达P3N-PIPO-GFP融合蛋白，发现P3N-PIPO-GFP融合蛋白定位于细胞壁上，呈点状结构，并且能与胞间连丝定位MarkerPDLP1-mRFP共定位，证明P3N-PIPO定位于胞间连丝。1.3.2.2P3N-PIPO促进自身的细胞间移动在没有病毒RNA的情况下，许多移动蛋白可以在细胞间移动。2012年，Vijayapalani等测试了P3N-PIPO在细胞间移动中的能力。构建了P3N-PIPO-GFP表达载体(Vijayapalani等,2012)。该构建体在推定的移码位点（GGAAAAAA）插入一个核苷酸，以表达P3N-PIPO而不移码。用编码GFP或P3N-PIPO-GFP的质粒分别注射本氏烟草叶片。用单独编码GFP的质粒接种（hpb）48小时后，绿色荧光被限制在单个细胞中，并且从未扩散到相邻细胞中。P3N-PIPO-GFP在24hpb处以点状夹杂物的形式聚集在细胞周围，到48hpb时，不仅观察到P3N-PIPO-GFP的运动，还有4–5个细胞的荧光细胞，表明存在明显的细胞间移动。因此，正如其他病毒MP一样，P3N-PIPO-GFP的P3N-PIPO部分允许蛋白质移动到相邻细胞。1.3.2.3P3N-PIPO与寄主蛋白互作鉴定互作的寄主蛋白是了解P3N-PIPO在马铃薯Y病毒属病毒侵染中功能的有力证据。Wei等证明P3N-PIPO定位于胞间连丝，可以在植物体内与CI互作，二者以特定比例形成复合体，调控胞间连丝相关结构的形成和病毒的移动(Wei等,2010;Carrington,2010)。
山东农业大学硕士学位论文9Vijayapalan等使用酵母双杂交筛选到与TuMV的P3N-PIPO相互作用的阳离子结合蛋白PCaP1。在植物中验证了P3N-PIPO和PCaP1相互作用的特异性，其中发现P3N-PIPO与PCaP1共定位在质膜和质膜中(Vijayapalan等,2012)。2015年，Geng等发现番茄和本式烟中受发育调控的质膜蛋白（Developmentallyregulatedplasmamembraneprotein，DREPP）同时与P3N-PIPO和CI两种移动蛋白互作，一起调控TVBMV细胞间移动(Geng等,2015)。Geng等研究发现，P3N-PIPO的长度是可变的，只有满足长度要求的P3N-PIPO才可以介导病毒的移动。寄主蛋白NbDREPP定位在细胞壁，与P3N-PIPO和CI相互作用，它们都是马铃薯Y病毒运动复合体的基本组成部分。寄主蛋白NbDREPP通过依赖COPI和COPII的早期分泌途径流向细胞壁。沉默DREPP基因可阻碍TVBMV在本式烟和番茄中的移动。图1-3TVBMV细胞间移动模型（Geng等,2015）Figure1-3Themodelofcell-to-cellmovementofTVBMV(Gengetal.,2015)1.3.2.4P3N-PIPO参与病毒的协生作用不同植物病毒侵染寄主后可能出现协生现象。在普通烟（Nicotianatabacum）中，马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒（PVY）会产生协生作用，使症状严重性急剧增加，PVXRNA复制调控发生改变以及PVX病毒含量增加。但是这种协生作用在不同的寄主上表现不同。在本氏烟中，当PVX与PVY、TEV共同侵染时，虽然能够引起植株的症状严重，并且产生系统性坏死，但是PVX病毒积累量并没有显著上升(González-Jara等,2005)。三叶草黄脉病毒（ClYVV）和白三叶草花叶病毒（WClMV）混合感染豌豆（Pisumsativum）导致更为严重的疾病症状(Choi等,2013)。与混合的ClYVV/WClMV感染相似，基于WClMV的载体编码ClYVV的P3N-PIPO加剧了疾病症状。用编码ClYVV
【参考文献】：
期刊论文
[1]马铃薯Y病毒siRNA介导抗病基因工程研究进展[J]. 张威,白艳菊,范国权,高艳玲,申宇,张抒,郭炜,孟宪欣. 中国农学通报. 2014(09)
[2]马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化[J]. 杨炳辉,高亦兵. 检验检疫学刊. 2014(01)
[3]长乐市马铃薯病毒病流行原因与防治技术[J]. 邹雪玉. 福建农业科技. 2013(09)
[4]中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 高芳銮,沈建国,史凤阳,方治国,谢联辉,詹家绥. 中国农业科学. 2013(15)
[5]马铃薯Y病毒病的检测技术及防治策略[J]. 贾霁,肖启明,刘剑峰,周志成,刘双清,唐前君. 园艺与种苗. 2013(01)
[6]湖南省马铃薯主产区马铃薯病毒种类及流行分析[J]. 胡新喜,雷艳,何长征,刘明月,李炎林,宋勇,黄科,秦玉芝,熊兴耀,Nie Xianzhou. 中国马铃薯. 2012(06)
[7]蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4,5二磷酸之间相互调节作用的研究进展[J]. 陈兴娟,张熙东,张璇,杲海霞,张海林. 中国药理学通报. 2012(11)
[8]马铃薯Y病毒研究进展[J]. 胡新喜,何长征,熊兴耀,刘明月,宋勇,聂先舟. 中国马铃薯. 2009(05)
[9]番茄真核翻译起始因子4E基因RNA干涉及其抗病毒特性研究[J]. 张余洋,漆梅芳,叶志彪,李汉霞. 自然科学进展. 2008(05)
博士论文
[1]烟草脉带花叶病毒和马铃薯A病毒HC-Pro调控RNA沉默抑制、协生和致病力的机制[D]. 王洁.山东农业大学 2012
硕士论文
[1]病毒基因组连接蛋白影响烟草脉带花叶病毒致病性的机制[D]. 牟安丽.山东农业大学 2013
[2]芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析[D]. 王红艳.山东农业大学 2008
本文编号：2960420
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