AAV神经环路示踪病毒的改造和应用
发布时间：2021-01-07 09:11
神经元是人类大脑中的基本单元,它们互相连接,组成了复制而精密的神经环路。探究这些环路对于了解大脑的运作原理具有重大的意义。腺相关病毒（AAV）是标记神经环路的常用工具,也是基因治疗的重要载体之一。现有的具有逆向示踪能力的AAV工具种类较少,能够标记的神经环路也较少,并且标记效率还有待提高。这些不足限制了AAV病毒载体在神经环路逆向标记中的应用。本文主要通过定向突变和随机突变的方式,改造不同AAV病毒血清型的基因组,提高AAV载体在不同环路中的逆向示踪效率。改造涉及了AAV1型、2型和DJ型病毒。通过定点突变改造后的AAVDJR病毒载体获得了较强的逆向示踪纹状体到皮层、丘脑和杏仁核的能力。通过定向突变改造后的AAV2R-9M病毒在纹状体通路比原始的rAAV2-retro具有更高效的逆向示踪能力,并且本文还对比了AAV2R-9M病毒在黑质和杏仁核脑区注射的标记效果。本文还通过随机突变的方法建立了AAVDJR病毒Cap蛋白基因的突变文库,并运用体内进化的方式筛选出了在纹状体-黑质通路可能具有更强逆向标记效果的候选突变体。本论文改造了不同AAV病毒血清型的基因组,获得了多种突变体,并进行了测试...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)广东省
【文章页数】：107 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变
第2章AAV1型和AAVDJ型病毒的定向突变改造7图2.2在AAV血清型DJ型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变如图2.2所示，与AAV2型N382D的氨基酸突变对应的AAVDJ型突变位点为N384D突变，即在AAVDJ型的Cap蛋白第384位点将天冬酰胺（N）突变成了天冬氨酸（D）；对应AAV2型V708I突变为AAVDJ型T710I突变，即为在AAVDJ的Cap蛋白第710位点将苏氨酸（T）突变为异亮氨酸（I）；对应AAV2型588位点的插入为AAVDJ型的590位点插入，即在AAVDJ的Cap蛋白第590位点插入LADQDYTKTA十肽。因为AAV2型的氨基酸序列和AAVDJ型的序列差异，我们的设计中进行了一些调整，使AAVDJ的T710I突变位点旁边的氨基酸序列环境与AAV2一致，因此710位点的苏氨酸（T）和旁边的丝氨酸（S）一同突变为与AAV2-retro对应位点一致的氨基酸序列异亮氨酸（I）和天冬酰胺（N），即为图2.2中的绿色标记部分的序列。在AAVDJ病毒的Cap蛋白基因引入三组突变后的突变体命名为AAVDJR。之后再通过微量注射分别将病毒注射到小鼠特定脑区核团，对病毒标记相应环路的效率进行测试，再对比分析。2.2实验材料与步骤2.2.1实验试剂和耗材2.2.1.1实验常用药品本文主要使用的试剂及购买厂商信息详见下表2.1。
AAV神经环路示踪病毒的改造和应用303、将小鼠脑组织放置在模具中，加入OTC没过小鼠脑组织。4、取一些无水乙醇，加入干冰，制造出冷冻环境。5、把模具放入冷冻的无水乙醇中进行速冻，使小鼠脑组织固定在OTC中。6、利用切片机对小鼠脑组织进行切片，厚度为50μm/片。7、将切好的脑片收集到装有冻存液的12孔板中，4℃保存2.2.5.3荧光成像1、将目标脑片用PBS清洗3次，每次15min，摇床转速为200r/min。2、用DAPI溶液染色15min，摇床转速为80r/min。染色后用PBS清洗脑片3次，每次15min，摇床转速为200r/min。3、将脑片贴于载玻片上，用封片剂封片。4、利用玻片扫描对脑片分别进行不同荧光通道的成像，并导出图片。2.3实验结果2.3.1AAV1R和AAVDJR的Cap基因突变载体的构建和测序结果2.3.1.1AAV1R图2.3在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变
【参考文献】：
期刊论文
[1]Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses[J]. Jiamin Li,Taian Liu,Yun Dong,Kunio Kondoh,Zhonghua Lu. Neuroscience Bulletin. 2019(05)
本文编号：2962290
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)广东省
【文章页数】：107 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变
第2章AAV1型和AAVDJ型病毒的定向突变改造7图2.2在AAV血清型DJ型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变如图2.2所示，与AAV2型N382D的氨基酸突变对应的AAVDJ型突变位点为N384D突变，即在AAVDJ型的Cap蛋白第384位点将天冬酰胺（N）突变成了天冬氨酸（D）；对应AAV2型V708I突变为AAVDJ型T710I突变，即为在AAVDJ的Cap蛋白第710位点将苏氨酸（T）突变为异亮氨酸（I）；对应AAV2型588位点的插入为AAVDJ型的590位点插入，即在AAVDJ的Cap蛋白第590位点插入LADQDYTKTA十肽。因为AAV2型的氨基酸序列和AAVDJ型的序列差异，我们的设计中进行了一些调整，使AAVDJ的T710I突变位点旁边的氨基酸序列环境与AAV2一致，因此710位点的苏氨酸（T）和旁边的丝氨酸（S）一同突变为与AAV2-retro对应位点一致的氨基酸序列异亮氨酸（I）和天冬酰胺（N），即为图2.2中的绿色标记部分的序列。在AAVDJ病毒的Cap蛋白基因引入三组突变后的突变体命名为AAVDJR。之后再通过微量注射分别将病毒注射到小鼠特定脑区核团，对病毒标记相应环路的效率进行测试，再对比分析。2.2实验材料与步骤2.2.1实验试剂和耗材2.2.1.1实验常用药品本文主要使用的试剂及购买厂商信息详见下表2.1。
AAV神经环路示踪病毒的改造和应用303、将小鼠脑组织放置在模具中，加入OTC没过小鼠脑组织。4、取一些无水乙醇，加入干冰，制造出冷冻环境。5、把模具放入冷冻的无水乙醇中进行速冻，使小鼠脑组织固定在OTC中。6、利用切片机对小鼠脑组织进行切片，厚度为50μm/片。7、将切好的脑片收集到装有冻存液的12孔板中，4℃保存2.2.5.3荧光成像1、将目标脑片用PBS清洗3次，每次15min，摇床转速为200r/min。2、用DAPI溶液染色15min，摇床转速为80r/min。染色后用PBS清洗脑片3次，每次15min，摇床转速为200r/min。3、将脑片贴于载玻片上，用封片剂封片。4、利用玻片扫描对脑片分别进行不同荧光通道的成像，并导出图片。2.3实验结果2.3.1AAV1R和AAVDJR的Cap基因突变载体的构建和测序结果2.3.1.1AAV1R图2.3在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三组对应突变
【参考文献】：
期刊论文
[1]Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses[J]. Jiamin Li,Taian Liu,Yun Dong,Kunio Kondoh,Zhonghua Lu. Neuroscience Bulletin. 2019(05)
本文编号：2962290
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