利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究

发布时间：2021-01-09 15:22

　　CRISPR/Cas9是发现于古细菌和细菌中的一种获得性免疫防御机制,通过摄取入侵的外源DNA短片段最终形成宿主的间隔序列,从而介导对病毒和质粒的获得性抗性。由于该系统相对于以前的基因编辑方法更简单易行、可靠高效、靶标精准而被广泛应用到多种生物的基因编辑中,成为一个准确打靶的基因编辑工具。本研究以本氏烟草为材料,利用CRISPR/Cas9技术实现本氏烟草内源PDS（Phytoenedesaturase,八氢番茄红素脱氢酶）基因和外源GFP（Green Fluorescent Protein,绿色荧光蛋白）基因的编辑工作,建立了本氏烟草CRISPR/Cas9系统基因编辑的瞬时表达系统和稳定遗传转化体系,进而探讨了 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用,为将来开展其它内源基因的生物学功能研究奠定了基础。本论文针对本氏烟草内源基因PDS和外源基因GFP分别预测了 3个和4个靶标位点,并设计合成了相应的guide序列和构建了双元表达重组载体。其中,将中间克隆载体psgR-Cas9-At质粒成功地改造成了操作性强的In-Fusion克隆载体psgR-Cas9-IF-At。将成功构建... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 CRISPR/CAs9和PTG技术
        1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发展及分类
        1.1.2 CRISPR/Cas的组成和结构
        1.1.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制
        1.1.4 CRISPR/Cas9系统的应用
        1.1.5 CRISPR/Cas9的多位点编辑技术
        1.1.6 CRISPR/Cas9与ZFNs和TALENs的比较
    1.2 植物组织培养及稳定转化
        1.2.1 植物组织培养的发展历程
        1.2.2 植物组织遗传转化
        1.2.3 植物瞬时表达
        1.2.4 模式植物本氏烟草
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料与试剂
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 克隆载体
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 靶位点的预测,guide序列的设计及克隆
        2.2.2 重组子的双元表达载体亚克隆
        2.2.3 利用In-Fusion克隆技术构建编辑载体
        2.2.4 PDS基因多个位点编辑的载体克隆
        2.2.5 pGREB32重组载体的构建
        2.2.6 感受态细胞的制备
        2.2.7 农杆菌介导真空注射法侵染本氏烟草叶片
        2.2.8 CTAB法提取烟叶片草基因组DNA
        2.2.9 基因组RE-PCR
        2.2.10 基因组PCR-RE
        2.2.11 本氏烟草瞬时表达系统中多位点编辑效果的检测
        2.2.12 本氏烟草叶圆盘转化
第三章 实验结果与分析
    3.1 PDS靶位点GUIDE序列的克隆
        3.1.1 PDS基因的靶标位点guide序列的克隆
        3.1.2 GFP基因的靶标位点guide序列的克隆
    3.2 PCAMBIA-GUIDE双元表达重组载体的构建
    3.3 本氏烟草瞬时表达编辑效果的鉴定
        3.3.1 PDS基因组DNA-RE PCR鉴定
        3.3.2 基因组DNA PCR-RE鉴定
    3.4 PTG技术多位点克隆
    3.5 PDS基因多位点编辑效果的检测
    3.6 本氏烟草再生体系的建立及稳定遗传株系的获得
        3.6.1 本氏烟草遗传转化体系的建立
第四章 讨论
    4.1 瞬时表达的CRISPR/CAS9系统的编辑效果分析
    4.2 CRISPR/CAs9系统在本氏烟草稳定遗传转化的探究
参考文献
附录1
致谢
攻读硕士学位期间取得的成果


【参考文献】：
期刊论文
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[2]抗逆基因GmUBC2的大豆胚尖遗传转化以及抗性材料的鉴定[J]. 张洁,赵甜甜,郑文永,商蕾,王月影,邱丽娟,王冬梅.  河北农业大学学报. 2016(02)
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[4]农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究[J]. 孙蔓莉,孟玉玲,张强,黄桂艳,单卫星.  西北农业学报. 2015(01)
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[6]CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展[J]. 李辉,施振旦.  江苏农业学报. 2013(04)
[7]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇.  生物化学与生物物理进展. 2013(08)
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[9]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao.  Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[10]植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展[J]. 赵文婷,魏建和,刘晓东,高志晖.  生物技术通讯. 2013(02)



本文编号：2966912