海栖热袍菌内切-β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌构建及发酵条件优化

发布时间：2021-01-12 06:58

　　内切-β-1,4-葡聚糖酶是纤维素酶系中的主要成员,可以将可溶性纤维素水解成还原性的寡糖。在酶的众多生物学性质中,其热稳定性非常重要,由于对高温环境表现极强耐受力的嗜热菌细胞中含有耐高温酶系而极具应用价值和开发潜力。虽然生长在海底火山环境中的严格厌氧嗜热微生物海栖热袍菌（Thermotoga maritima）具有产生内切-β-1,4-葡聚糖酶的能力,但由于培养困难,不适用工业规模的开发利用,采用分子生物学手段对该菌的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因进行克隆,构建可以常温培养的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）工程菌意义重大。1)海栖热袍菌中编码内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因（TM1525）,具有825 bp的开放阅读框,编码274个氨基酸。以分泌型pHT43穿梭质粒为载体,构建融合His标签蛋白的重组TM1525克隆质粒pHT43-TM1525,并通过大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α扩增,大量制备重组质粒。通过电转将重组质粒转入B.subtilis WB800N中进行表达。利用水解圈实验证明重组蛋白表达情况及水解纤维素酶活性。发酵上清液和菌体沉淀的... 

【文章来源】：东华大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 极端环境微生物和耐热酶
        1.1.1 极端环境微生物
        1.1.2 海洋微生物
        1.1.3 海栖热袍菌
    1.2 纤维素和内切-β-1,4-葡聚糖酶
        1.2.1 纤维素
        1.2.2 内切-β-1,4-葡聚糖酶
    1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
        1.3.1 枯草芽孢杆菌WB800N
        1.3.2 pHT43穿梭载体
        1.3.3 乳糖操纵子与诱导剂IPTG
        1.3.4 电转化法
    1.4 酶学性质研究
        1.4.1 生物信息学软件分析理化性质
        1.4.2 酶学性质研究
    1.5 工程菌发酵条件优化
        1.5.1 单因素试验
        1.5.2 响应面优化
    1.6 研究意义和研究内容
        1.6.1 研究意义
        1.6.2 研究内容
第二章 枯草芽孢杆菌表达系统的构建
    2.1 主要实验仪器和材料
        2.1.1 菌种、质粒
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要实验材料
    2.2 实验原理与方法
        2.2.1 PCR扩增及产物的回收
        2.2.2 pMD18-TM1525的构建
        2.2.3 pHT43-TM1525重组质粒的构建
        2.2.4 pHT43-TM1525重组菌的筛选与鉴定
        2.2.5 枯草芽孢杆菌WB800N表达系统的建立
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PCR扩增
        2.3.2 pMD18-TM1525阳性克隆菌株的筛选与鉴定
        2.3.3 pHT43-TM1525阳性克隆菌株的筛选与鉴定
        2.3.4 枯草芽孢杆菌阳性克隆菌株的鉴定
    2.4 本章小结
第三章 目的蛋白的表达纯化及酶学性质分析
    3.1 实验材料、实验设备及实验试剂
        3.1.1 菌种
        3.1.2 实验设备
        3.1.3 实验试剂
    3.2 实验原理及方法
        3.2.1 目的蛋白的表达
        3.2.2 发酵条件的优化
        3.2.3 目的蛋白的纯化
        3.2.4 酶学性质分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 目的蛋白的表达
        3.3.2 发酵条件的优化
        3.3.3 蛋白纯化
        3.3.4 酶学性质分析
    3.4 本章小结
第四章 响应面优化
    4.1 主要实验仪器和材料
        4.1.1 菌种
        4.1.2 主要实验仪器
        4.1.3 主要实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 响应面试验设计
        4.2.2 测定方法
        4.2.3 回归模型验证
    4.3 结果与分析
        4.3.1 响应面试验方案及结果
        4.3.2 模型方差分析
        4.3.3 响应面交互作用分析
        4.3.4 响应面优化结果验证
    4.4 本章小结
第五章 总结与展望
    5.1 总结
    5.2 展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]海栖热袍菌耐热葡聚糖内切酶EG12B基因的克隆表达及酶学特性分析[J]. 王珊珊,任艳艳,张涛,路宏朝,王令.  家畜生态学报. 2019(04)
[2]海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达[J]. 王希晖,刘洪玲,隋松森,杨少杰,王瑞明,王腾飞.  食品与发酵工业. 2019(07)
[3]麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表达[J]. 刘强,王腾飞,汪俊卿,王希晖,王瑞明.  生物技术通报. 2017(03)
[4]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰.  生物技术通报. 2015(02)
[5]大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达[J]. 梁晓梅,黎明,成堃,贾红红,路福平.  生物技术通报. 2011(06)
[6]少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达[J]. 张欢,王凤寰,田平芳,谭天伟,李文进.  生物技术通报. 2010(01)



本文编号：2972385