马齿苋提取物体外抑制猪流行性腹泻病毒复制的作用分析
发布时间：2021-01-21 16:45
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的急性肠道传染病。对猪尤其是仔猪的危害极为严重,可导致仔猪腹泻,脱水甚至死亡。自2010年以来,以PEDV变异株引起的高发病率和高死亡率为特征的PED在世界范围内大面积流行,导致大量仔猪患病死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。尽管近年来在阐明PED的分子流行病学,诊断,预防和治疗方面取得了进展,但其流行爆发仍在继续增加,给养猪业和国际贸易带来了严峻的问题。马齿苋（Portulaca oleracea L.,PO）为石竹目马齿苋科马齿苋属的一年生草本植物。广泛的分布于世界各地的热带和亚热带地区,属于药食两用中药,具有清热解毒、凉血止血、止泻止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有消炎、抗菌抗病毒、抗氧化、降血糖血脂、增强免疫力等多种作用。为了探究马齿苋对猪流行性腹泻病毒的抑制作用以及作用机制,本研究首先制备了马齿苋提取物,评估了马齿苋提取物对VH细胞和Vero细胞的药物安全范围,然后用PEDV感染VH细胞和Vero细胞,...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV基因组结构(Leeetal.，2015)
马齿苋提取物体外抑制猪流行性腹泻病毒复制的作用分析20图2给药方式示意Figure2.ExperimentalprotocolstoidentifytheinhibitoryeffectsofPOonPEDVinfection.2.2.1.7免疫荧光检测病毒蛋白的表达2.2.1.7.1溶液配制1)PBT1(pH=7.2)：称取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，驴血清5mL，用1×PBS定容至100mL，漩涡振荡至完全溶解，用0.22μm滤器过滤并分装，-20℃保存。2)PBT2(pH=7.2)：称取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，用1×PBS定容至100mL，漩涡振荡至完全溶解，用0.22μm滤器过滤并分装，-20℃保存。3)封片剂：甘油与1×PBS以1:1比例混合，室温保存。2.2.1.7.2间接免疫荧光将处于对数生长期的VH细胞(4×105个/mL)消化吹打，转移到预先放置了细胞爬片的24孔细胞培养板中，于37℃5%CO2培养箱中过夜培养。将培养孔设为Negative、Positive、6.25、12.5和25五个组，接毒前换成分别含有0、0、6.25、12.5和25mg/mLPO的培养基作用6h，接毒后再换成相同的培养基作用48h(Negative组不接毒)。间接免疫荧光操作如下：1)爬片预处理：将24孔细胞培养板内的培养基弃除，1×PBS清洗三次，每次3min；2)细胞固定：向处理好的爬片上滴加200μL4%的甲醛溶液，固定10min；3)细胞通透：将固定过的细胞爬片，用1×PBS洗三遍，每遍3min，加入200μL含0.2%的TritionX-100的1×PBS，室温通透8min；
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1病毒滴度水平的变化PEDVJX16毒株是由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室在山东莒县某规模养殖场的病猪体内分离到的变异毒株，该病毒成功分离后在Vero细胞上扩增了40代，更换为VH细胞继续传代，赠与我实验室的为第54代，病毒滴度为106.5TCID50/mL。将病毒在VH细胞上连续传至80代，每5代测定TCID50，病毒滴度随代次增加而升高，至80代时达到107.5TCID50/mL（图3）。图3不同代次JX16毒株病毒滴度的变化Figure3.ChangesinvriustitersofJX16strainsindifferentgenerations3.2不同浓度马齿苋觅水提物对细胞活性的影响在针对PEDV进行抗病毒筛选之前，确定所有样品对VH细胞和Vero细胞活性的影响，以此来确定药物的安全范围。在不同浓度（0、6.25、12.5、25、50和100mg/mL）马齿苋提取物PO、PO-P和PO-P孵育48h后，用CCK-8试剂检测细胞活力。如图4A所示，用≤25mg/mL的PO处理对VH细胞活力没有显著影响（P＞0.05），而高浓度的PO（＞25mg/mL）则明显降低了细胞活性。高于25mg/mL的PO-S和PO-P浓度会对细胞造成一定的损害。在Vero细胞上，PO提取物的安全浓度为≤12.5mg/mL（4B）。根据结果，选择在VH细胞上不超过25mg/mL和在Vero细胞上12.5mg/mL的马齿苋提取物浓度，作为进一步探究药物对PEDV复制
【参考文献】：
期刊论文
[1]马齿苋“成分-活性-中药功效-疾病”研究进展及关联分析[J]. 秦月雯,侯金丽,王萍,王岚,殷小杰,张毅,俞励平,许海玉. 中草药. 2020(07)
[2]马齿苋调节人肝癌细胞肺转移裸鼠的血液代谢组学分析[J]. 林玩福,张夏炎,吕狄亚,赵沙沙,曹静文,郁沙莎,程彬彬,翟笑枫,郑国银. 中医肿瘤学杂志. 2020(01)
[3]马齿苋多糖理化性质及其抗氧化活性研究[J]. 叶丹蕾,韩苗苗,吴玉兰,陶晗,汪惠丽. 合肥工业大学学报(自然科学版). 2019(10)
[4]马齿苋总黄酮对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 蔡帆,张彦,臧林泉. 中药药理与临床. 2019(03)
[5]马齿苋结合态多酚和自由态多酚抑制肝癌细胞HepG-2增殖及诱导细胞凋亡的研究[J]. 王浩毓,赵惠玲,李宏全. 山西农业大学学报(自然科学版). 2019(04)
[6]不同治疗方案对猪自然感染猪流行性腹泻的疗效观察[J]. 王艳丰,张丁华,朱金凤,赵秀敏. 猪业科学. 2018(12)
[7]马齿苋多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠组织IL-6/STAT3及NF-κB的影响[J]. 范文涛,王攀红,王倩. 中国应用生理学杂志. 2018(03)
[8]马齿苋醇提取物对结肠癌细胞及其干细胞体外增殖作用的机理研究[J]. 熊祎虹,邓超,白文,刘宇,姚小芹,金黑鹰. 北京中医药大学学报. 2018(01)
[9]马齿苋多糖体外免疫调节活性研究[J]. 陶贵斌,何慧楠,李雪惠,刘雪莹,齐滨,刘莉. 食品研究与开发. 2017(17)
[10]马齿苋多糖对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响[J]. 孟祥乐,薛磊,张振巍,桂新景,陈玉欢,唐进法,李伟霞,曹英杰,赵娅,李学林. 中国新药杂志. 2017(11)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFN-β产生及激活NF-κB机理研究[D]. 曹丽艳.东北农业大学 2015
硕士论文
[1]马齿苋酰胺E和马齿苋提取物的神经保护和抗炎活性研究[D]. 李玲玉.山东大学 2018
[2]马齿苋多糖的提取分离及其抗溃疡性结肠炎作用机理研究[D]. 汪荔.陕西中医药大学 2017
本文编号：2991530
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV基因组结构(Leeetal.，2015)
马齿苋提取物体外抑制猪流行性腹泻病毒复制的作用分析20图2给药方式示意Figure2.ExperimentalprotocolstoidentifytheinhibitoryeffectsofPOonPEDVinfection.2.2.1.7免疫荧光检测病毒蛋白的表达2.2.1.7.1溶液配制1)PBT1(pH=7.2)：称取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，驴血清5mL，用1×PBS定容至100mL，漩涡振荡至完全溶解，用0.22μm滤器过滤并分装，-20℃保存。2)PBT2(pH=7.2)：称取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，用1×PBS定容至100mL，漩涡振荡至完全溶解，用0.22μm滤器过滤并分装，-20℃保存。3)封片剂：甘油与1×PBS以1:1比例混合，室温保存。2.2.1.7.2间接免疫荧光将处于对数生长期的VH细胞(4×105个/mL)消化吹打，转移到预先放置了细胞爬片的24孔细胞培养板中，于37℃5%CO2培养箱中过夜培养。将培养孔设为Negative、Positive、6.25、12.5和25五个组，接毒前换成分别含有0、0、6.25、12.5和25mg/mLPO的培养基作用6h，接毒后再换成相同的培养基作用48h(Negative组不接毒)。间接免疫荧光操作如下：1)爬片预处理：将24孔细胞培养板内的培养基弃除，1×PBS清洗三次，每次3min；2)细胞固定：向处理好的爬片上滴加200μL4%的甲醛溶液，固定10min；3)细胞通透：将固定过的细胞爬片，用1×PBS洗三遍，每遍3min，加入200μL含0.2%的TritionX-100的1×PBS，室温通透8min；
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1病毒滴度水平的变化PEDVJX16毒株是由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室在山东莒县某规模养殖场的病猪体内分离到的变异毒株，该病毒成功分离后在Vero细胞上扩增了40代，更换为VH细胞继续传代，赠与我实验室的为第54代，病毒滴度为106.5TCID50/mL。将病毒在VH细胞上连续传至80代，每5代测定TCID50，病毒滴度随代次增加而升高，至80代时达到107.5TCID50/mL（图3）。图3不同代次JX16毒株病毒滴度的变化Figure3.ChangesinvriustitersofJX16strainsindifferentgenerations3.2不同浓度马齿苋觅水提物对细胞活性的影响在针对PEDV进行抗病毒筛选之前，确定所有样品对VH细胞和Vero细胞活性的影响，以此来确定药物的安全范围。在不同浓度（0、6.25、12.5、25、50和100mg/mL）马齿苋提取物PO、PO-P和PO-P孵育48h后，用CCK-8试剂检测细胞活力。如图4A所示，用≤25mg/mL的PO处理对VH细胞活力没有显著影响（P＞0.05），而高浓度的PO（＞25mg/mL）则明显降低了细胞活性。高于25mg/mL的PO-S和PO-P浓度会对细胞造成一定的损害。在Vero细胞上，PO提取物的安全浓度为≤12.5mg/mL（4B）。根据结果，选择在VH细胞上不超过25mg/mL和在Vero细胞上12.5mg/mL的马齿苋提取物浓度，作为进一步探究药物对PEDV复制
【参考文献】：
期刊论文
[1]马齿苋“成分-活性-中药功效-疾病”研究进展及关联分析[J]. 秦月雯,侯金丽,王萍,王岚,殷小杰,张毅,俞励平,许海玉. 中草药. 2020(07)
[2]马齿苋调节人肝癌细胞肺转移裸鼠的血液代谢组学分析[J]. 林玩福,张夏炎,吕狄亚,赵沙沙,曹静文,郁沙莎,程彬彬,翟笑枫,郑国银. 中医肿瘤学杂志. 2020(01)
[3]马齿苋多糖理化性质及其抗氧化活性研究[J]. 叶丹蕾,韩苗苗,吴玉兰,陶晗,汪惠丽. 合肥工业大学学报(自然科学版). 2019(10)
[4]马齿苋总黄酮对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 蔡帆,张彦,臧林泉. 中药药理与临床. 2019(03)
[5]马齿苋结合态多酚和自由态多酚抑制肝癌细胞HepG-2增殖及诱导细胞凋亡的研究[J]. 王浩毓,赵惠玲,李宏全. 山西农业大学学报(自然科学版). 2019(04)
[6]不同治疗方案对猪自然感染猪流行性腹泻的疗效观察[J]. 王艳丰,张丁华,朱金凤,赵秀敏. 猪业科学. 2018(12)
[7]马齿苋多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠组织IL-6/STAT3及NF-κB的影响[J]. 范文涛,王攀红,王倩. 中国应用生理学杂志. 2018(03)
[8]马齿苋醇提取物对结肠癌细胞及其干细胞体外增殖作用的机理研究[J]. 熊祎虹,邓超,白文,刘宇,姚小芹,金黑鹰. 北京中医药大学学报. 2018(01)
[9]马齿苋多糖体外免疫调节活性研究[J]. 陶贵斌,何慧楠,李雪惠,刘雪莹,齐滨,刘莉. 食品研究与开发. 2017(17)
[10]马齿苋多糖对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响[J]. 孟祥乐,薛磊,张振巍,桂新景,陈玉欢,唐进法,李伟霞,曹英杰,赵娅,李学林. 中国新药杂志. 2017(11)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFN-β产生及激活NF-κB机理研究[D]. 曹丽艳.东北农业大学 2015
硕士论文
[1]马齿苋酰胺E和马齿苋提取物的神经保护和抗炎活性研究[D]. 李玲玉.山东大学 2018
[2]马齿苋多糖的提取分离及其抗溃疡性结肠炎作用机理研究[D]. 汪荔.陕西中医药大学 2017
本文编号：2991530
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