两种水貂肠炎细小病毒的分子生物学特征比较研究
发布时间：2021-02-04 07:51
随着水貂养殖业规模化程度的不断提高,疫病的流行严重妨碍了水貂养殖行业的健康发展,造成了重大的经济损失。水貂肠炎细小病毒（mink enteritis parvoviruses,MEV）是严重危害水貂的主要病原之一,发病率和死亡率较高。在生产实践中,接种水貂肠炎细小病毒疫苗是防控水貂病毒性肠炎的重要措施。但近年来,疫苗免疫失败的例子时有发生,深入了解MEV的分子演化特征对于水貂病毒性肠炎的防控具有重要意义。2015-2016年,本实验室在我国山东省主要水貂养殖地区表现肠炎症状的水貂体内分离到8株细小病毒,命名为MEV-SD1MEV-SD8,其中MEV-SD7、MEV-SD8 VP2蛋白300位氨基酸为Val,而MEV-SD1MEV-SD6 VP2蛋白300位氨基酸为Ala,与猫细小病毒（feline parvoviruses,FPV）VP2蛋白300位氨基酸一致。本课题以MEV-SD1、MEV-SD7为研究对象,采用HA/HI、IFA、生长曲线测定、流式细胞术等方法,对MEV-SD1、MEV-SD7的交叉免疫反应、感染效率、增殖以及对细胞的损伤...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
1 综述
1.1 食肉动物细小病毒
1.2 水貂肠炎细小病毒的病原学特性
1.2.1 水貂肠炎细小病毒的形态特点和理化性质
1.2.2 水貂肠炎细小病毒的结构
1.2.3 水貂肠炎细小病毒编码蛋白及功能
1.2.4 水貂肠炎细小病毒的复制机制
1.3 水貂肠炎细小病毒的流行病学特征
1.3.1 水貂肠炎细小病毒的致病机理
1.3.2 水貂肠炎细小病毒的感染和传播特性
1.3.3 水貂肠炎细小病毒的临床症状
1.4 水貂肠炎细小病毒的流行病学
1.4.1 水貂肠炎细小病毒的起源与进化
1.4.2 水貂肠炎细小病毒感染的宿主特异性
1.5 水貂肠炎细小病毒的预防与诊断
1.5.1 水貂肠炎细小病毒的预防
1.5.2 水貂肠炎细小病毒的诊断
1.6 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒来源
2.1.2 细胞、菌株和载体
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物
2.1.5 实验耗材与试剂
2.1.6 实验仪器
2.2 方法
2.2.1 主要试剂的配制
2.2.2 CRFK细胞的复苏及冻存
2.2.3 CRFK细胞的培养和传代
2.2.4 MEV的培养与增殖
2.2.5 MEV感染力测定
2.2.6 多步生长曲线
2.2.7 间接免疫荧光
2.2.8 细胞凋亡检测
2.2.9 细胞周期检测
2.2.10 血凝试验
2.2.11 血凝抑制试验
2.2.12 细胞活性检测
2.2.13 实时荧光定量PCR
2.2.14 小鼠抗MEV单因子血清制备
2.2.15 MEV-SD1和MEV-SD7 感染性克隆的构建
2.2.16 pM-MEV-SD1和pM-MEV-SD7 重组质粒转染CRFK细胞及病毒拯救
2.2.17 MEV-SD1、MEV-SD7 VP2300 位氨基酸定点突变病毒的拯救
3 结果
3.1 MEV-SD1和MEV-SD7 的分子生物学特征比较
3.1.1 MEV-SD1、MEV-SD7对CRFK细胞感染效率的比较
3.1.2 MEV-SD1、MEV-SD7在CRFK细胞中复制能力的比较
3.1.3 MEV-SD1、MEV-SD7 诱导细胞凋亡的比较
3.1.4 MEV-SD1、MEV-SD7 对细胞周期阻滞作用的比较
3.1.5 MEV-SD1、MEV-SD7 交叉中和试验
3.2 MEV-SD1和MEV-SD7 感染性克隆的构建及全基因组序列分析
3.2.1 pM-MEV-SD1和pM-MEV-SD7 重组质粒的构建及病毒拯救
3.2.2 MEV-SD1和MEV-SD7 全基因组序列分析
3.3 VP2 蛋白A300V对水貂肠炎细小病毒分子生物学特性的影响
3.3.1 MEV-SD1、MEV-SD7 VP2300 位氨基酸定点突变病毒的拯救
3.3.2 VP2 A300V对病毒感染效率的影响
3.3.3 VP2 A300V突变病毒对细胞活性的影响
3.3.4 VP2 A300V对突变病毒增殖规律的影响
3.3.5 VP2 A300V突变病毒对感染细胞上清液中病毒滴度的影响
3.3.6 VP2 A300V突变病毒诱导细胞凋亡的比较
3.3.7 VP2 A300V突变病毒对细胞周期阻滞作用的比较
4 讨论
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国貂、狐、貉存栏数量统计报告（2016年）[J]. 张志明. 特种经济动植物. 2016(12)
[2]水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 于永乐,张传美,杨海燕,杨瑞梅,张洪亮,单虎. 兽类学报. 2015(01)
[3]水貂传染性肠炎病毒的分离和鉴定[J]. 蔡秀磊,付琦,苏建青,褚秀玲,李玉保. 黑龙江畜牧兽医. 2014(13)
[4]犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价[J]. 刘洁,牟林琳,何文辉,李晶梅,谢红玲,廖园园,朱薇,漆世华,温文生. 中国兽药杂志. 2014(03)
[5]水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析[J]. 张庆明,王玉平,李莹莹,闫新武,雷连成. 中国畜牧兽医. 2013(06)
[6]犬细小病毒病基因工程疫苗的研究进展[J]. 徐进,孙世琪,曹随忠,孙德惠,郭慧琛. 中国兽医科学. 2012(05)
[7]犬细小病毒:从起源到进化[J]. 赵建军,闫喜军,吴威. 微生物学报. 2011(07)
[8]水貂肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 王建科,程世鹏,易立,杨莘,罗彬,许红丽,闫喜军,武华. 中国兽医科学. 2011(02)
[9]水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用[J]. 张海玲,闫喜军,柴秀丽,吴威,易立,罗国良,田洪宇,邵西群,王凤雪. 特产研究. 2007(02)
[10]水貂肠炎细小病毒分离鉴定[J]. 闫喜军,柴秀丽,吴威,王凤雪,邵西群,赵传芳,姜莉莉. 畜牧与兽医. 2007(03)
博士论文
[1]水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究[D]. 毛亚萍.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]水貂肠炎细小病毒分离株的分子生物学特性及其致病性研究[D]. 刁非非.山东农业大学 2017
[2]肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D]. 杨洋.吉林大学 2013
[3]貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究[D]. 康洪涛.中国农业科学院 2012
[4]水貂肠炎细小病毒抗原性分析及其特异性马源抗体的制备[D]. 左静.吉林大学 2011
[5]犬细小病毒基因疫苗的研究[D]. 陈芹.扬州大学 2004
本文编号：3017990
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
前言
1 综述
1.1 食肉动物细小病毒
1.2 水貂肠炎细小病毒的病原学特性
1.2.1 水貂肠炎细小病毒的形态特点和理化性质
1.2.2 水貂肠炎细小病毒的结构
1.2.3 水貂肠炎细小病毒编码蛋白及功能
1.2.4 水貂肠炎细小病毒的复制机制
1.3 水貂肠炎细小病毒的流行病学特征
1.3.1 水貂肠炎细小病毒的致病机理
1.3.2 水貂肠炎细小病毒的感染和传播特性
1.3.3 水貂肠炎细小病毒的临床症状
1.4 水貂肠炎细小病毒的流行病学
1.4.1 水貂肠炎细小病毒的起源与进化
1.4.2 水貂肠炎细小病毒感染的宿主特异性
1.5 水貂肠炎细小病毒的预防与诊断
1.5.1 水貂肠炎细小病毒的预防
1.5.2 水貂肠炎细小病毒的诊断
1.6 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒来源
2.1.2 细胞、菌株和载体
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物
2.1.5 实验耗材与试剂
2.1.6 实验仪器
2.2 方法
2.2.1 主要试剂的配制
2.2.2 CRFK细胞的复苏及冻存
2.2.3 CRFK细胞的培养和传代
2.2.4 MEV的培养与增殖
2.2.5 MEV感染力测定
2.2.6 多步生长曲线
2.2.7 间接免疫荧光
2.2.8 细胞凋亡检测
2.2.9 细胞周期检测
2.2.10 血凝试验
2.2.11 血凝抑制试验
2.2.12 细胞活性检测
2.2.13 实时荧光定量PCR
2.2.14 小鼠抗MEV单因子血清制备
2.2.15 MEV-SD1和MEV-SD7 感染性克隆的构建
2.2.16 pM-MEV-SD1和pM-MEV-SD7 重组质粒转染CRFK细胞及病毒拯救
2.2.17 MEV-SD1、MEV-SD7 VP2300 位氨基酸定点突变病毒的拯救
3 结果
3.1 MEV-SD1和MEV-SD7 的分子生物学特征比较
3.1.1 MEV-SD1、MEV-SD7对CRFK细胞感染效率的比较
3.1.2 MEV-SD1、MEV-SD7在CRFK细胞中复制能力的比较
3.1.3 MEV-SD1、MEV-SD7 诱导细胞凋亡的比较
3.1.4 MEV-SD1、MEV-SD7 对细胞周期阻滞作用的比较
3.1.5 MEV-SD1、MEV-SD7 交叉中和试验
3.2 MEV-SD1和MEV-SD7 感染性克隆的构建及全基因组序列分析
3.2.1 pM-MEV-SD1和pM-MEV-SD7 重组质粒的构建及病毒拯救
3.2.2 MEV-SD1和MEV-SD7 全基因组序列分析
3.3 VP2 蛋白A300V对水貂肠炎细小病毒分子生物学特性的影响
3.3.1 MEV-SD1、MEV-SD7 VP2300 位氨基酸定点突变病毒的拯救
3.3.2 VP2 A300V对病毒感染效率的影响
3.3.3 VP2 A300V突变病毒对细胞活性的影响
3.3.4 VP2 A300V对突变病毒增殖规律的影响
3.3.5 VP2 A300V突变病毒对感染细胞上清液中病毒滴度的影响
3.3.6 VP2 A300V突变病毒诱导细胞凋亡的比较
3.3.7 VP2 A300V突变病毒对细胞周期阻滞作用的比较
4 讨论
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国貂、狐、貉存栏数量统计报告（2016年）[J]. 张志明. 特种经济动植物. 2016(12)
[2]水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 于永乐,张传美,杨海燕,杨瑞梅,张洪亮,单虎. 兽类学报. 2015(01)
[3]水貂传染性肠炎病毒的分离和鉴定[J]. 蔡秀磊,付琦,苏建青,褚秀玲,李玉保. 黑龙江畜牧兽医. 2014(13)
[4]犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价[J]. 刘洁,牟林琳,何文辉,李晶梅,谢红玲,廖园园,朱薇,漆世华,温文生. 中国兽药杂志. 2014(03)
[5]水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析[J]. 张庆明,王玉平,李莹莹,闫新武,雷连成. 中国畜牧兽医. 2013(06)
[6]犬细小病毒病基因工程疫苗的研究进展[J]. 徐进,孙世琪,曹随忠,孙德惠,郭慧琛. 中国兽医科学. 2012(05)
[7]犬细小病毒:从起源到进化[J]. 赵建军,闫喜军,吴威. 微生物学报. 2011(07)
[8]水貂肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 王建科,程世鹏,易立,杨莘,罗彬,许红丽,闫喜军,武华. 中国兽医科学. 2011(02)
[9]水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用[J]. 张海玲,闫喜军,柴秀丽,吴威,易立,罗国良,田洪宇,邵西群,王凤雪. 特产研究. 2007(02)
[10]水貂肠炎细小病毒分离鉴定[J]. 闫喜军,柴秀丽,吴威,王凤雪,邵西群,赵传芳,姜莉莉. 畜牧与兽医. 2007(03)
博士论文
[1]水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究[D]. 毛亚萍.中国农业大学 2016
硕士论文
[1]水貂肠炎细小病毒分离株的分子生物学特性及其致病性研究[D]. 刁非非.山东农业大学 2017
[2]肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D]. 杨洋.吉林大学 2013
[3]貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究[D]. 康洪涛.中国农业科学院 2012
[4]水貂肠炎细小病毒抗原性分析及其特异性马源抗体的制备[D]. 左静.吉林大学 2011
[5]犬细小病毒基因疫苗的研究[D]. 陈芹.扬州大学 2004
本文编号：3017990
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