CRISPR/Cas9介导绒山羊Tβ4基因定点敲入的研究

发布时间：2021-02-06 20:51

　　作为毛纺产业的优质原材料,绒山羊所产的羊绒纤细柔软。但如今在绒山羊育种过程中存在为提高羊绒产量盲目杂交,造成羊绒质量降低等问题,亟待以现代生物技术实现品种改良。胸腺素β4（Thymosinbeta4,Tβ4）可以诱导毛囊形成进而调节哺乳动物毛发生长,加速毛囊干细胞的分化、迁移,还可通过促进血管生成达到间接促进毛发生长的作用。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在绒山羊骨骼肌卫星细胞上进行Tβ4基因的定点敲入,结合体细胞核移植技术获得Tβ4基因定点敲入的绒山羊,为绒山羊的遗传育种提供新的方法。1、Tβ4基因定点整合载体的构建使用麻省理工学院的CRISPR设计软件在CCR5的第二外显子上设计了 6对20bp的靶序列,以gRNA-T2为模板,使用整体PCR的方法,扩增得到大小为455bp的gRNA。利用surveyor突变检测试剂盒进行效率检测,最终确定了一对突变效率较高的gRNA,用于下一步实验。同时构建了由上游同源臂、Kap6.1启动子、Tβ4基因、polyA和下游同源臂5部分组成的Tβ4同源重组载体。2、Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得采用电穿孔转染法将Cas9环状质粒、4... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 CRISPR/Cas9系统概述
    1 CRISPR-Cas9的研究进程
    2 CRISPR-Cas9的基因座结构
    3 CRISPR-Cas9的作用原理
    4 CRISPR-Cas9在动物基因编辑上的应用
    5 CRISPR-Cas9系统的优势与局限
    6 结语
第二章 CRISPR/Cas9介导绒山羊Tβ4基因定点敲入的研究
    1 引言
        1.1 Tβ4基因定点整合载体的构建
        1.2 Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得
        1.3 Tβ4基因定点整合绒山羊的制备
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要仪器设备
            2.1.2 试剂与耗材
            2.1.3 实验材料
        2.2 方法
            2.2.1 Tβ4基因定点整合载体的构建
            2.2.2 Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得
            2.2.3 Tβ4基因定点整合绒山羊的制备
    3 结果
        3.1 Tβ4基因定点整合载体的构建
            3.1.1 gRNA表达载体的构建
            3.1.2 SURVEYOR酶切效率检测
            3.1.3 Tβ4基因的获得
            3.1.4 上下游同源臂的获得
            3.1.5 Tβ4同源重组载体的构建
        3.2 Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得
            3.2.1 单克隆细胞系的获得
            3.2.2 Tβ4基因随机整合细胞系的鉴定
            3.2.3 Tβ4基因定点整合细胞系的鉴定
        3.3 Tβ4基因定点整合绒山羊的制备
            3.3.1 卵母细胞的采集与体外成熟
            3.3.2 重构胚的构建及融合
            3.3.3 重构胚的体外培养及移植
            3.3.4 转基因绒山羊的接产及鉴定
    4 讨论
        4.1 Tβ4 基因定点整合载体的构建
        4.2 Tβ4基因定点整合单克隆细胞系的获得
        4.3 Tβ4基因定点整合绒山羊的制备
结论
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR-Cas9研究进展及在基因治疗上的应用[J]. 刘瑞琪,王玮玮,吴勇延,赵秋云,王勇胜,卿素珠.  中国生物工程杂志. 2016(10)
[2]猪体细胞核移植技术研究进展[J]. 张宏燕,信吉阁.  生物技术通报. 2016(08)
[3]CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用[J]. 王玮玮,刘瑞琪,吴勇延,杨严格,王勇胜,卿素珠.  畜牧兽医学报. 2016(07)
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博士论文
[1]源于嗜热链球菌的真核CRISPR/Cas9系统的建立、优化及其应用研究[D]. 徐坤.西北农林科技大学 2015
[2]阿尔巴斯白绒山羊不同种类成体干细胞对转基因克隆效率影响的研究[D]. 任宇.内蒙古大学 2014
[3]利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究[D]. 袁建龙.内蒙古大学 2013

硕士论文
[1]CRISPR/Cas9系统介导羊MSTN基因敲除和定点整合fat-1基因的研究[D]. 张驹.内蒙古大学 2016
[2]CRISPR-Cas9技术介导阿尔巴斯白绒山羊MSTN基因敲除的研究[D]. 刘健.内蒙古大学 2015
[3]CRISPR-Cas9介导FGF5敲除及Noggin过表达对毛发生长相关因子影响[D]. 张蒙.内蒙古大学 2015
[4]CRISPR/Cas9技术对绵羊肌肉卫星细胞MSTN基因的靶向敲除研究[D]. 李聪.中国农业科学院 2015
[5]Tβ4转基因绒山羊中目的基因拷贝数及表达量与产绒性能关系的研究[D]. 郭栋东.内蒙古大学 2014



本文编号：3021072