促进小鼠牙胚间充质细胞牙源性潜能维持的培养体系优化研究
发布时间：2021-02-18 00:56
牙齿是人类生长发育过程中重要的器官,牙齿损伤和牙齿脱落已成为最常见的口腔疾病,牙齿缺失会导致咀嚼、语言和美观等方面出现问题,会不同程度地影响人类的生活质量。现有传统的牙齿修复方法,存在使用寿命短、使用感受差、生物相容性差等问题。因此,如何获得在功能和形态上类似天然牙齿的再生牙齿成为目前口腔医学领域研究的热点。牙齿的发育依赖于来自口腔上皮和周围的间充质之间的相互作用,同时受到各种信号通路的调控。在牙齿形成过程中,组织之间的相互作用表现为,其中一种组织产生诱导信号,另一种组织接收并响应信号,前一种组织具有的诱导能力称为牙源性潜能（odontogenic potential）。上世纪的经典重组实验证实了牙源性潜能首先出现在牙胚上皮中,继而在蕾状期（embryo day 12-13,E12-13）转移到间充质中。可见,早期的牙胚上皮可以诱导牙源性或非牙源性的间充质形成牙齿;而蕾状期之后的牙胚间充质可以诱导牙源性上皮或非牙源性上皮形成牙齿。由此,帽状期E14.5的小鼠牙胚间充质细胞常常作为构建再生牙齿的诱导信号细胞来源。然而,新鲜分离的牙胚间充质细胞数量十分有限,大大制约了再生牙齿相关的体外构建...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
牙齿发育过程示意图
第1章绪论3信号通路在牙齿发育过程中介导牙胚发育的起始，调控牙齿的形态发生。参与上皮-间充质相互作用的信号通路主要包括：骨形成蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子（FGF）、刺猬蛋白（Shh）和Wnt等多种信号分子家族[24,25]。这些可扩散的信号分子通过协同或拮抗作用，共同调节牙齿的生长发育[26,27]。图2调控牙齿发育的信号分子--ThesleffI.Australiandentaljournal,2014.1.2.2.1BMP家族BMP是一组多功能同源二聚体蛋白，是转化生长因子（TGF）-β超家族的一部分，在许多附属器官的发生发育中起作用。BMP蛋白作为配体，可以结合具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Ⅱ型和I型受体，激活依赖Smad的经典途径和不依赖Smad的非经典途径[28]。在经典途径中，当BMP配体与受体结合，II型受体使I型受体磷酸化，继而结合效应分子使Smads蛋白磷酸化，Smads进入细胞核调节靶基因的表达。BMP也可以通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的非经典途径激活受体。BMP家族中Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp7等多个基因都参与了牙胚的发育，其中Bmp4被认为在牙齿形态发生中起着重要作用，Bmp4在牙胚中的表达模式与牙源性潜能从上皮转移到间充质的时间一致[29]。在牙胚发育早期，Bmp4出现在上皮，通过调控Pax9的表达来调节牙齿的生长[30]。在牙胚发育后期，Bmp4除了在釉结中表达，在间充质中表达的Bmp4还能激活牙胚间充质中Msx1的表达，Msx1也可以正反馈调节Bmp4的表达。Msx1基因缺失的小鼠会出现颅面发育缺陷和牙齿发育不全等问题，而Bmp4可以拯救Msx1突变的牙胚，形成牙釉质和牙本质[31]。
第1章绪论8结果，我们确定了本课题的研究内容。本课题中为了进一步维持牙胚间充质细胞在体外的牙源性潜能，明确体外培养过程中牙源性潜能变化的机制，我们在无血清的培养条件基础上进一步优化了牙胚间充质细胞的体外培养体系，将体外培养的细胞与牙源性无诱导能力的上皮重组获得再生的牙齿。通过对优化前后的体外细胞样品进行转录组测序，解析维持牙源性潜能的关键因子，过表达或抑制培养基中的因子进行验证，为全牙再生的研究提供相关的科学依据。实验的具体方法是，选择14.5天胎龄的ICR孕鼠，分离胎鼠的磨牙牙胚，通过胰酶消化获得牙胚间充质细胞，将细胞培养在MEF和KSR培养基以及我们优化的新型培养基中，体外培养并传代，收集不同时间点的细胞分别与E14.5的小鼠牙胚上皮组织重组，体外培养一天后将构建的重组样品移植到小鼠肾包膜内，术后3周检测成牙情况。通过qPCR、CCK8、组织学检测等实验对细胞和移植物进行鉴定。根据成牙的情况，对备份的牙胚间充质细胞RNA进行转录组测序，通过GO注释对优化前后的体外细胞样品分析，寻找体外维持牙胚间充质细胞牙源性潜能的因子，并对因子进行验证实验，探索成牙相关的机制。实验设计流程如下图所示：图3实验流程图
【参考文献】：
期刊论文
[1]Making a tooth:growth factors,transcription factors,and stem cells[J]. Yan Ding ZHANG1,2, Zhi CHEN1, Yi Qiang SONG3, Chao LIU2, Yi Ping CHEN2,3,* 1College of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430072, China 2College of Bioengineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China 3Division of Developmental Biology, Department of Cell and Molecular Biology, Tulane University, New Orleans, LA 70118, USA. Cell Research. 2005(05)
本文编号：3038803
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
牙齿发育过程示意图
第1章绪论3信号通路在牙齿发育过程中介导牙胚发育的起始，调控牙齿的形态发生。参与上皮-间充质相互作用的信号通路主要包括：骨形成蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子（FGF）、刺猬蛋白（Shh）和Wnt等多种信号分子家族[24,25]。这些可扩散的信号分子通过协同或拮抗作用，共同调节牙齿的生长发育[26,27]。图2调控牙齿发育的信号分子--ThesleffI.Australiandentaljournal,2014.1.2.2.1BMP家族BMP是一组多功能同源二聚体蛋白，是转化生长因子（TGF）-β超家族的一部分，在许多附属器官的发生发育中起作用。BMP蛋白作为配体，可以结合具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Ⅱ型和I型受体，激活依赖Smad的经典途径和不依赖Smad的非经典途径[28]。在经典途径中，当BMP配体与受体结合，II型受体使I型受体磷酸化，继而结合效应分子使Smads蛋白磷酸化，Smads进入细胞核调节靶基因的表达。BMP也可以通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的非经典途径激活受体。BMP家族中Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp7等多个基因都参与了牙胚的发育，其中Bmp4被认为在牙齿形态发生中起着重要作用，Bmp4在牙胚中的表达模式与牙源性潜能从上皮转移到间充质的时间一致[29]。在牙胚发育早期，Bmp4出现在上皮，通过调控Pax9的表达来调节牙齿的生长[30]。在牙胚发育后期，Bmp4除了在釉结中表达，在间充质中表达的Bmp4还能激活牙胚间充质中Msx1的表达，Msx1也可以正反馈调节Bmp4的表达。Msx1基因缺失的小鼠会出现颅面发育缺陷和牙齿发育不全等问题，而Bmp4可以拯救Msx1突变的牙胚，形成牙釉质和牙本质[31]。
第1章绪论8结果，我们确定了本课题的研究内容。本课题中为了进一步维持牙胚间充质细胞在体外的牙源性潜能，明确体外培养过程中牙源性潜能变化的机制，我们在无血清的培养条件基础上进一步优化了牙胚间充质细胞的体外培养体系，将体外培养的细胞与牙源性无诱导能力的上皮重组获得再生的牙齿。通过对优化前后的体外细胞样品进行转录组测序，解析维持牙源性潜能的关键因子，过表达或抑制培养基中的因子进行验证，为全牙再生的研究提供相关的科学依据。实验的具体方法是，选择14.5天胎龄的ICR孕鼠，分离胎鼠的磨牙牙胚，通过胰酶消化获得牙胚间充质细胞，将细胞培养在MEF和KSR培养基以及我们优化的新型培养基中，体外培养并传代，收集不同时间点的细胞分别与E14.5的小鼠牙胚上皮组织重组，体外培养一天后将构建的重组样品移植到小鼠肾包膜内，术后3周检测成牙情况。通过qPCR、CCK8、组织学检测等实验对细胞和移植物进行鉴定。根据成牙的情况，对备份的牙胚间充质细胞RNA进行转录组测序，通过GO注释对优化前后的体外细胞样品分析，寻找体外维持牙胚间充质细胞牙源性潜能的因子，并对因子进行验证实验，探索成牙相关的机制。实验设计流程如下图所示：图3实验流程图
【参考文献】：
期刊论文
[1]Making a tooth:growth factors,transcription factors,and stem cells[J]. Yan Ding ZHANG1,2, Zhi CHEN1, Yi Qiang SONG3, Chao LIU2, Yi Ping CHEN2,3,* 1College of Stomatology, Wuhan University, Wuhan 430072, China 2College of Bioengineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China 3Division of Developmental Biology, Department of Cell and Molecular Biology, Tulane University, New Orleans, LA 70118, USA. Cell Research. 2005(05)
本文编号：3038803
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