USP15、USP21抑制剂筛选及去泛素化酶活性检测系统改进

发布时间：2017-04-13 21:38

  本文关键词：USP15、USP21抑制剂筛选及去泛素化酶活性检测系统改进，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蛋白质的泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰方式,被泛素分子修饰的蛋白在去泛素化酶的作用下可以水解掉所带的泛素。在过去的5到10年间,许多研究结果都表明去泛素化酶在体内的许多生理过程中起到了重要作用,而去泛素化酶的异常与包括肿瘤、神经退行性疾病、血液疾病、感染在内的多种人类疾病相关。因此,许多科研机构和医药公司都在努力寻找去泛素化酶的抑制剂。泛素特异性水解酶USP15被报道可以调节TGF-p信号通路,促进肿瘤的发生发展。还可以通过稳定MDM2,负调控T细胞的活性,以及调节p53的功能,抑制USP15的活性,可以诱导肿瘤的凋亡,以及促进抗肿瘤T细胞应答。因此,USP15被认为是一个非常好的抗肿瘤治疗靶点。此外,也有文章指出,抑制USP15的活性,也可以作为治疗帕金森的一个途径。然而,到目前为止,并没有发现一个特异性针对USP15的抑制剂,PR-619虽然可以很好的抑制USP15的活性,但PR-619是一个广谱的去泛素化酶抑制剂,缺乏特异性导致其应用受到了极大的限制。泛素特异性水解酶USP21被报道可以负调控NF-KB信号通路和RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型干扰素信号通路,可以去H2A的单泛素化进而调控下游因子的转录,还可以稳定GATA3进而上调FOXP3在Treg细胞中的水平。此外,我们实验室也发现了USP21在固有免疫以及干细胞干性维持中具有重要作用。然而,与USP15一样,虽然PR-619可以抑制USP21的去泛素化酶活性,但缺乏特异性,目前特异性针对USP21的抑制剂也没有被报道。在本文中,我们应用Ub-Nanoluc去泛素化酶活性检测系统分别对USP15和USP21进行了小分子抑制剂的筛选,并在体外水平证明了筛选出的小分子化合物确实分别可以抑制USP15和USP21的去泛素化酶活性。为了筛选去泛素化酶的抑制剂,研究人员开发出了多种检测去泛素化酶活性的方法。我们实验室利用一种新型稳定灵敏度高的报告基因Nanoluc开发出了一套检测去泛素化酶活性的方法,但是由于所用固相载体为Ni-NTA beads,操作十分繁杂。为了简化操作,提高方法的通量性,在本文的研究中,我们将固相载体换成了镍包被的96孔白板。改进后的方法操作更为简便,更适合于高通量的筛选工作。综上所述,本文筛选了去泛素化酶USP15和USP21的小分子抑制剂,并在体外水平证明了其抑制作用。此外,本文还对基于Nanoluc报告基因的去泛素化酶活性检测系统进行了改进,使其操作更为便捷易行,更适合于高通量的筛选工作。
【关键词】：USP15 USP21 抑制剂 去泛素化酶活性检测
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q503
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 研究背景及文献综述11-27
• 第一节 去泛素化酶概述11-21
• 第二节 去泛素化酶活性检测方法概述21-25
• 第三节 去泛素化酶抑制剂研究进展25-27
• 第二章 材料与方法27-51
• 第一节 实验材料27-32
• 第二节 常用实验试剂的配制32-40
• 第三节 实验方法40-51
• 第三章 结果与分析51-83
• 第一节 去泛素化酶USP15抑制剂的筛选51-62
• 第二节 去泛素化酶USP21抑制剂筛选62-69
• 第三节 通量化去泛素化酶活性检测系统的改进69-83
• 第四章 总结与讨论83-85
• 附录Ⅰ USP15抑制剂初筛85-92
• 附录Ⅱ 化合物对Nanoluc读值的影响92-93
• 附录Ⅲ 缩略词93-94
• 附录Ⅳ 科研成果94-95
• 参考文献95-103
• 致谢103-104

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