两株稀有放线菌的CRISPR/Cas9基因组编辑系统的建立及其初步应用

发布时间：2021-03-28 00:11

　　放线菌天然产物在人类的疾病史上发挥着非常重要的作用,为人类贡献了许多抗生素。遗传操作在放线菌天然产物药物研究中扮演了极其重要的角色,而传统的同源重组方式往往由于周期长、依赖于筛选标记、筛选量大等劣势,极大地增加了工作量,同时也限制了其应用范围。因此,我们迫切需要完善放线菌的遗传操作体系,以更有效率地对放线菌次级代谢潜能进行挖掘研究。本实验室一直以来致力于放线菌天然产物挖掘,并且构建"万株基因组"库用于研究。本研究这对两种特殊的稀有放线菌海洋疣孢菌MS100137和嗜甲基拟无支酸菌,构建了基于CRISPR/Cas9的遗传操作体系,并将其初步应用于次级代谢产物的相关研究。主要取得了以下几点结果:1.利用遗传学手段初步解析proximicin生物合成机制（1）在海洋疣孢菌中建立了高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功删除掉了长达90kb的片段,效率高于75%;（2）应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MS100137中NRPS基因簇进行删除工作,发现C17和C12与proximicins的生物合成相关,这两个基因簇均含有大量的未知功能基因,预示着其中有新的机制;（3）通过对MS1... 

【文章来源】：安徽大学安徽省 211工程院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 微生物天然产物研究现状
    1.2 NRPS天然产物生物合成
    1.3 放线菌基因组编辑的技术手段
        1.3.1 同源重组
        1.3.2 Cre/loxp系统
        1.3.3 I-SceI核酸内切酶
    1.4 CRISPR/Cas9技术在放线菌中的应用
    1.5 稀有放线菌及其代谢产物
    1.6 研究内容和意义
第二章 利用CRISPR系统初步解析proximicin生物合成机制
    2.1 研究背景
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 海洋疣孢菌中CRISPR/Cas9技术的建立及大片段基因删除
        2.3.2 新颖proximicins检测
        2.3.3 proximicin合成基因簇初步解析
        2.3.4 Proximicins生物合成机制推测
    2.4 小结与讨论
第三章 嗜甲基拟无支酸菌中amychelin新类似物的获得以及菌株底盘构建
    3.1 研究背景
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
    3.3 实验结果
T的生理特征">        3.3.1 A.methanolica 239^T的生理特征
T的建立及attB位点引入">        3.3.2 CRISPR/Cas9方法在A.methanolica 239^T的建立及attB位点引入
        3.3.3 新化合物的分离及结构解析
        3.3.4 活性鉴定
    3.4 小结与讨论
第四章 结论与展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表的文章和专利



本文编号：3104499