基于CRISPR/Cas13的vlincRNA生物学功能研究
发布时间：2021-03-31 02:50
长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核酸且不编码蛋白质的RNA。尽管lncRNA被报道参与了诸多生物学过程,其生物学意义和分子机制仍不十分清晰,并且存在诸多争议。反向遗传学技术是揭示lncRNA生物学功能的重要研究手段,然而众多相关研究表明现有的研究技术通常具有较高的非特异性作用和脱靶效应,或无法准确判断表型变化是否由转录本导致。除了技术上的限制,lncRNA本身特征,如与功能元件重叠、尚不明确的作用机制、可变剪切、核定位和丰度低等,都使其功能研究充满挑战。本课题研究一类新型lncRNA,极长基因间非编码RNA（very long intergenic non-coding RNAs,vlincRNAs）,应用最新的反向遗传学技术CRISPR/Cas13系统,对vlincRNA进行功能鉴定。该方法具有比其他现有方法（如RNAi）更高的特异性,并且靶向RNA而非DNA（如CRISPR/Cas9系统）,于是可以准确地将表型分配给转录本。生存筛选是指抗癌药物作用于癌细胞造成压力使细胞伤亡或存活的过程。本课题将CRISPR/Cas13系...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
靶向不同对象的反向遗传学技术
第2章基础实验材料与方法11图2.1Cas13质粒和gRNA质粒示意图人类慢性髓系白血病细胞K562（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），是一种悬浮细胞，已经有研究表明，K562细胞系是常见细胞系中vlincRNA含量较多的一种[22]，这使得K562细胞系非常适合用于研究vlincRNA。本课题的所有改造细胞系都是由K562细胞改造获得。2.1.2药物本课题选择了三种抗肿瘤药物，分别是依托泊苷（Etoposide，AbMoleBioScience，美国），拓扑异构酶II抑制剂，可诱导DNA损伤，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。米林（Mirin，AbMoleBioScience，美国），是DNA双链断裂感应因子MRE11A的抑制剂，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。伊马替尼（Imatinib，AbMoleBioScience，美国），K562的癌基因BCR-ABL的抑制剂，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。这三种抗肿瘤药物将会作为接下来筛选研究vlincRNA以及生存筛选实验的压力来源。Etoposide在临床上以用于治疗包括白血病的多种癌症[49]，并且在许多DNA损伤相关研究中作为DNA损伤诱导剂[48]，Imatinib是治疗慢性骨髓性白血病的药物，对由于染色体易位产生的费城染色体导而导致的慢性骨髓性白血病治疗效果十分显著[50]。尽管Mirin没有在临床上用于治疗恶性肿瘤，但是，根据本实验室的早期实验数据，Mirin可以诱导K562细胞
第3章CRISPR/Cas13细胞文库构建21图3.1Cas13mRNADox诱导表达倍数3.2筛选备选vlincRNA及mRNA3.2.1实验设计为了选择合适的研究对象vlincRNA，我们设计了如图3.2所示的实验流程。将K562细胞，用Etoposide、Mirin或Imatinib处理3小时和6小时，并且提取处理前后的总RNA，进行RNA-seq，根据RNA-seq数据的结果，筛选出合适的备选vlincRNA.
本文编号：3110636
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
靶向不同对象的反向遗传学技术
第2章基础实验材料与方法11图2.1Cas13质粒和gRNA质粒示意图人类慢性髓系白血病细胞K562（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），是一种悬浮细胞，已经有研究表明，K562细胞系是常见细胞系中vlincRNA含量较多的一种[22]，这使得K562细胞系非常适合用于研究vlincRNA。本课题的所有改造细胞系都是由K562细胞改造获得。2.1.2药物本课题选择了三种抗肿瘤药物，分别是依托泊苷（Etoposide，AbMoleBioScience，美国），拓扑异构酶II抑制剂，可诱导DNA损伤，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。米林（Mirin，AbMoleBioScience，美国），是DNA双链断裂感应因子MRE11A的抑制剂，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。伊马替尼（Imatinib，AbMoleBioScience，美国），K562的癌基因BCR-ABL的抑制剂，固体粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。这三种抗肿瘤药物将会作为接下来筛选研究vlincRNA以及生存筛选实验的压力来源。Etoposide在临床上以用于治疗包括白血病的多种癌症[49]，并且在许多DNA损伤相关研究中作为DNA损伤诱导剂[48]，Imatinib是治疗慢性骨髓性白血病的药物，对由于染色体易位产生的费城染色体导而导致的慢性骨髓性白血病治疗效果十分显著[50]。尽管Mirin没有在临床上用于治疗恶性肿瘤，但是，根据本实验室的早期实验数据，Mirin可以诱导K562细胞
第3章CRISPR/Cas13细胞文库构建21图3.1Cas13mRNADox诱导表达倍数3.2筛选备选vlincRNA及mRNA3.2.1实验设计为了选择合适的研究对象vlincRNA，我们设计了如图3.2所示的实验流程。将K562细胞，用Etoposide、Mirin或Imatinib处理3小时和6小时，并且提取处理前后的总RNA，进行RNA-seq，根据RNA-seq数据的结果，筛选出合适的备选vlincRNA.
本文编号：3110636
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