基于蛋白质组学和代谢组学研究多粘类芽孢杆菌SC2-M1中NrgA的功能

发布时间：2021-05-17 21:26

　　NrgA是定位于细胞膜上的高亲和力铵转运蛋白,在生命的所有领域都是保守的,负责铵离子在膜上的运输,并且仅在铵离子浓度低时起作用。NrgA基因突变会导致其铵离子转运能力减弱或丧失,因此研究认为NrgA对于维持细胞内环境的稳态是不可或缺的。实验室之前的蛋白质组学数据显示,在多粘类芽孢杆菌SC2-M1中,NrgA基因可能与抗生素合成有关。本研究利用同源重组的方法在多粘类芽孢杆菌SC2-M1中对NrgA基因进行敲除,结合蛋白质组学和代谢组学进一步探究了NrgA在多粘类芽孢杆菌中的功能。与野生型SC2-M1相比,突变菌株的铵离子转运能力明显减弱,鞭毛及其运动性丧失,拮抗细菌性能增强。通过4D LFQ定量蛋白质组学检测野生株SC2-M1和突变株NrgA-q的差异表达蛋白,共鉴定得到20个差异表达的蛋白质,其中13个蛋白上调,7个蛋白下调。对差异表达蛋白进行功能分类,发现差异表达蛋白主要集中于多种物质的转运和代谢过程,其中包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、辅酶、脂质的转运和代谢等。差异蛋白代谢通路富集分析发现NrgA与嘌呤代谢途径和亚精胺/鸟氨酸代谢途径密切相关,NrgA可能通过影响铵离子的转运,使p... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物根际促生细菌(PGPR)
    1.2 多粘类芽孢杆菌概述
        1.2.1 多粘类芽孢杆菌起源及菌种特性
        1.2.2 多粘类芽孢杆菌促生机理及应用
        1.2.3 多粘类芽孢杆菌SC2及SC2-M1
    1.3 NrgA基因及Nrg A铵转运蛋白
    1.4 细菌鞭毛及其运动性
    1.5 嘌呤代谢调控通路
    1.6 蛋白质组学的应用
    1.7 代谢组学的应用
    1.8 研究目的、研究内容和技术路线
        1.8.1 研究目的
        1.8.2 研究内容
        1.8.3 技术路线
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 培养基与溶液
        2.1.3 酶和试剂
        2.1.4 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 构建基因敲除菌株
            2.2.1.1 多粘类芽孢杆菌SC2-M1 基因组DNA的提取
            2.2.1.2 引物设计
            2.2.1.3 PCR扩增目的片段
            2.2.1.4 PCR产物胶回收
            2.2.1.5 连接克隆载体
            2.2.1.6 转化大肠杆菌
            2.2.1.7 质粒提取
            2.2.1.8 酶切和连接表达载体
            2.2.1.9 多粘类芽孢杆菌SC2-M1 感受态的制备
            2.2.1.10 多粘类芽孢杆菌SC2-M1 的质粒转化过程(电转化法)
            2.2.1.11 基因敲除菌株的筛选
        2.2.2 RNA的提取
        2.2.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)
        2.2.4 生长曲线测定
        2.2.5 鞭毛观察(电镜观察法)
        2.2.6 运动性检测
        2.2.7 拮抗性检测
        2.2.8 蛋白质组学
            2.2.8.1 蛋白提取
            2.2.8.2 胰酶酶解
            2.2.8.3 液相色谱-质谱联用分析
            2.2.8.4 数据库搜索
            2.2.8.5 质谱质控检测
            2.2.8.6 差异表达蛋白的筛选
            2.2.8.7 生物信息学分析
        2.2.9 代谢组学
            2.2.9.1 代谢物提取
            2.2.9.2 LC-MS/MS分析
            2.2.9.3 数据预处理和质控
            2.2.9.4 化合物检测和注释
            2.2.9.5 统计分析及差异代谢物的筛选
            2.2.9.6 差异代谢物分析
3 结果与分析
    3.1 多粘类芽孢杆菌SC2-M1 菌株NrgA基因功能分析
        3.1.1 多粘类芽孢杆菌SC2-M1 菌株NrgA基因氨基酸序列比对分析
        3.1.2 构建多粘类芽孢杆菌NrgA基因敲除菌株
        3.1.3 多粘类芽孢杆菌NrgA基因敲除菌株(Nrg A-q)的表型分析
            3.1.3.1 生长曲线
            3.1.3.2 细菌拮抗
            3.1.3.3 鞭毛及运动性观察
        3.1.4 多粘类芽孢杆菌NrgA基因敲除菌株(Nrg A-q)的相关基因定量分析
    3.2 蛋白质组学分析结果
        3.2.1 差异表达蛋白的筛选
        3.2.2 差异表达蛋白的功能分类
            3.2.2.1 亚细胞结构定位分类
            3.2.2.2 GO二级分类
            3.2.2.3 COG功能分类
        3.2.3 差异表达蛋白代谢通路富集分析
        3.2.4 差异表达蛋白互作分析
        3.2.5 相关差异表达蛋白分析
        3.2.6 鞭毛及运动性相关分析
    3.3 代谢组学分析结果
        3.3.1 代谢物检测和鉴定情况
        3.3.2 差异代谢物的筛选和聚类分析
        3.3.3 差异代谢物代谢通路富集分析
        3.3.4 拮抗性相关分析
    3.4 蛋白质组学和代谢组学联合分析结果
        3.4.1 通路富集分析
        3.4.2 多粘类芽孢杆菌SC2-M1中NrgA相关功能路线
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]PGPR作用机制及其在农业上的应用研究进展[J]. 张利亚,李嫚.  现代农业科技. 2019(24)
[2]多粘类芽孢杆菌及其脂肽化合物研究进展[J]. 郭赛赛,张敬泽.  农药学学报. 2019(Z1)
[3]广谱抑菌性多粘类芽孢杆菌的筛选及其细菌素理化特性[J]. 周涛,满文曾,吴晓营,万玉莲,马宁,胡容.  食品工业科技. 2019(24)
[4]细菌鞭毛在生理活动中的作用[J]. 李交昆,南美花,吴学玲,余润兰,曾伟民.  生命科学. 2018(06)
[5]多粘类芽孢杆菌研究进展[J]. 田宇曦,闵勇,杨自文,王开梅.  湖北农业科学. 2017(18)
[6]细菌鞭毛推进器复杂的蛋白组成和精致的空间结构[J]. 张维佳,李颖,WU LongFei.  科学通报. 2014(20)
[7]细菌运动及趋化信号转导网络的研究[J]. 袁军华.  中国科学技术大学学报. 2014(05)
[8]RpoN和RpoS参与细菌鞭毛合成与趋化调控的研究进展[J]. 刘晓东,吴港,杨智敏,燕永亮,林敏,张云华.  江苏农业科学. 2013(12)
[9]细菌鞭毛系统的研究进展[J]. 曾县平.  安徽农业科学. 2012(27)
[10]变异链球菌、血链球菌及嗜酸乳杆菌代谢组学鉴定的初步研究[J]. 熊萍,周京琳,肖丽英,孔祥丽,李继遥,贾向明,李伟.  华西口腔医学杂志. 2008(05)

博士论文
[1]多粘类芽孢杆菌SC2形态分化的分子机制研究[D]. 侯晓阳.山东农业大学 2015

硕士论文
[1]多粘类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）SC2基因敲除体系的建立[D]. 张文娣.山东农业大学 2013
[2]多粘类芽孢杆菌SC2的全基因组测序[D]. 王翠翠.山东农业大学 2011
[3]辣椒根际拮抗菌筛选、鉴定及多粘类芽孢杆菌SC2拮抗相关基因克隆[D]. 朱辉.山东农业大学 2008
[4]鞭毛细菌游动机理及其模型研究[D]. 崔俊文.上海交通大学 2007



本文编号：3192482