三种真核生物蛋白糖酰胺酶的可溶性重组表达与性质鉴定
发布时间：2021-05-20 00:06
糖酰胺酶（glycoamidase,EC 3.5.1.52）,全称为peptide-N-（N-acetyl-β-glucosaminyl）asparagine amidase（PNGase）,水解糖肽或糖蛋白 N-连接糖链的 N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基之间的酰胺键,释放出完整的寡糖链。真核细胞生物体内,尤其是在细胞质内质网周围广泛存在PNGase,其具有区分天然或变性糖蛋白的特性,与蛋白酶复合体依赖的蛋白降解系统协同作用,实现对细胞质中来自内质网合成的错误折叠糖蛋白的去糖基化处理。在已鉴定出的真核生物PNGase同源蛋白中,经序列分析显示存在由Cys,His和Asp组成的催化三联体,此催化三联体为转谷氨酰胺酶样超家族中的成员所共享,其成员表现出不同的生化活性,包括转谷氨酰胺酶、蛋白酶和PNGase等。所有这些催化活性都涉及酰胺键的形成或水解。作为真核PNGase的典型代表,酿酒酵母PNGase（yPnglp）研究最为透彻,研究者对其结构、功能、与其他蛋白关联等进行了深入研究,还有研究者进行了大肠杆菌重组表达和包涵体复性得到具有体外活性的重组yPnglp。同时有研究者发现来自于拟南...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 蛋白糖基化简介
1.1.1 蛋白N-糖基化过程及结构
1.1.2 蛋白N-糖链的功能
1.2 蛋白N-糖酰胺酶
1.2.1 原核生物来源的蛋白N-糖酰胺酶(PNGase F)
1.2.2 真核生物来源的蛋白N-糖酰胺酶(Png1p)
1.2.3 酵母蛋白N-糖酰胺酶
1.3 植物蛋白N-糖酰胺酶研究进展
1.4 本论文的目的和意义
第二章 拟南芥Png1p在大肠杆菌中的可溶性重组表达与性质鉴定
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和载体
2.2.2 主要试剂和试剂盒
2.2.3 主要仪器
2.2.4 主要培养基和试剂溶液的配置
2.3 实验方法
2.3.1 目的基因的获得
2.3.2 构建筛选大肠杆菌重组表达载体
2.3.3 重组蛋白AtPng1p的表达
2.3.4 重组蛋白的纯化
2.3.5 蛋白浓度及活性测定
2.4 实验结果
2.4.1 重组AtPng1p的可溶性表达,纯化及鉴定
2.4.2 重组AtPng1p的生化性质研究
2.5 讨论及小结
第三章 酿酒酵母及莱茵绿藻Png1p的克隆、重组表达与活性鉴定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株和载体
3.2.2 主要试剂和试剂盒
3.2.3 主要仪器
3.2.4 主要培养基和试剂溶液的配置
3.3 实验方法
3.3.1 酿酒酵母yPng1p编码基因的获得
3.3.2 莱茵绿藻PNGase编码基因的获得
3.3.3 大肠杆菌重组表达载体的构建及筛选
3.3.4 重组蛋白表达
3.3.5 重组蛋白纯化
3.3.6 蛋白浓度及活性测定
3.4 实验结果
3.4.1 莱茵绿藻的培养,总RNA提取及RT-PCR
3.4.2 两种重组Png1p的可溶性表达、纯化及鉴定
3.4.3 两种重组可溶性表达Png1p的活性鉴定
3.5 讨论及小结
全文总结
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
期刊论文
[1]Influence of Substrate Conformation on the Deglycosylation of Ribonuclease B by Recombinant Yeast Peptide:N-glycanase[J]. Shengjun WANG;Peng George WANG;and Qingsheng QI State Key Laboratory of Microbial Technology,Life Science Schooll,Shandong University,Jinan 250100,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(01)
[2]N-糖酰胺酶F在大肠杆菌中的高效表达及其脱糖基化作用研究[J]. 苏移山,王圣钧,王鹏,祁庆生. 生物工程学报. 2005(06)
本文编号：3196690
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 蛋白糖基化简介
1.1.1 蛋白N-糖基化过程及结构
1.1.2 蛋白N-糖链的功能
1.2 蛋白N-糖酰胺酶
1.2.1 原核生物来源的蛋白N-糖酰胺酶(PNGase F)
1.2.2 真核生物来源的蛋白N-糖酰胺酶(Png1p)
1.2.3 酵母蛋白N-糖酰胺酶
1.3 植物蛋白N-糖酰胺酶研究进展
1.4 本论文的目的和意义
第二章 拟南芥Png1p在大肠杆菌中的可溶性重组表达与性质鉴定
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和载体
2.2.2 主要试剂和试剂盒
2.2.3 主要仪器
2.2.4 主要培养基和试剂溶液的配置
2.3 实验方法
2.3.1 目的基因的获得
2.3.2 构建筛选大肠杆菌重组表达载体
2.3.3 重组蛋白AtPng1p的表达
2.3.4 重组蛋白的纯化
2.3.5 蛋白浓度及活性测定
2.4 实验结果
2.4.1 重组AtPng1p的可溶性表达,纯化及鉴定
2.4.2 重组AtPng1p的生化性质研究
2.5 讨论及小结
第三章 酿酒酵母及莱茵绿藻Png1p的克隆、重组表达与活性鉴定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株和载体
3.2.2 主要试剂和试剂盒
3.2.3 主要仪器
3.2.4 主要培养基和试剂溶液的配置
3.3 实验方法
3.3.1 酿酒酵母yPng1p编码基因的获得
3.3.2 莱茵绿藻PNGase编码基因的获得
3.3.3 大肠杆菌重组表达载体的构建及筛选
3.3.4 重组蛋白表达
3.3.5 重组蛋白纯化
3.3.6 蛋白浓度及活性测定
3.4 实验结果
3.4.1 莱茵绿藻的培养,总RNA提取及RT-PCR
3.4.2 两种重组Png1p的可溶性表达、纯化及鉴定
3.4.3 两种重组可溶性表达Png1p的活性鉴定
3.5 讨论及小结
全文总结
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
期刊论文
[1]Influence of Substrate Conformation on the Deglycosylation of Ribonuclease B by Recombinant Yeast Peptide:N-glycanase[J]. Shengjun WANG;Peng George WANG;and Qingsheng QI State Key Laboratory of Microbial Technology,Life Science Schooll,Shandong University,Jinan 250100,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(01)
[2]N-糖酰胺酶F在大肠杆菌中的高效表达及其脱糖基化作用研究[J]. 苏移山,王圣钧,王鹏,祁庆生. 生物工程学报. 2005(06)
本文编号：3196690
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3196690.html
