关于AtNAC091膜结合转录因子的基因克隆以及逆境胁迫下的生物学功能研究
发布时间：2021-07-03 09:09
植植物遭受逆境会导致内质网中大量蛋白无法折叠或错误折叠,从而引起内质网胁迫（ER stress）,此时细胞会通过启动未折叠蛋白应答途径（unfolded protein response,UPR）帮助蛋白折叠以缓解胁迫,而在这个途径中膜结合转录因子（membrane-associated transcription factor,MTF）发挥极其重要的作用。拟南芥中,已研究出NAC家族中的062、089、103都参与到内质网胁迫途径,通过调节下游基因来控制植物生命活动。在本研究鉴定了一个质膜相关转录因子AtNAC091（也称为TIP）,在内质网胁迫及其他非生物途径中也起着重要作用。在本论文中,1)首先用qRT-PCR分析NAC091在内质网胁迫下表达情况,确定NAC091受到内质网胁迫诱导上调;2)NAC091受内质网胁迫上调依赖于bZIP60,同时发现NAC091启动子序列上有一段经典的ERSE-I元件,该元件是内质网胁迫途径中的经典元件,进一步说明NAC091参与内质网胁迫途径;3)运用酵母双杂交及BiFC技术,发现NAC091具有转录激活活性和形成同源二聚体;4)利用激光共聚焦显...
【文章来源】：贵州师范大学贵州省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NAC蛋白的结构模式图(Ookaetal.,2003)
353.1NAC091在内质网胁迫诱导剂作用下表达上调TM、DTT是能够引起内质网发生胁迫的化学物质，通过添加其中的某一种来模拟内质网遭受胁迫的环境。为了判断NAC091是否会参与到内质网胁迫途径中？首先分别用TM(5μg/mL)和DTT(2mM)对生长10d的野生型拟南芥幼苗处理4h，并用DMSO处理的幼苗作为空白对照，然后分别对处理后的植株幼苗进行RNA的提取，并反转录成cDNA，利用qRT-PCR检测NAC091在不同处理下的表达差异（图2），与对照组(DMSO)相比较NAC091在TM和DTT处理4h的样品中，其表达量分别上调3.431和5.4倍，说明NAC091在内质网胁迫途径中表达量能够上调的。图2NAC091在内质网胁迫诱导剂处理下的表达分析用5μg/mL的TM和2mM的DTT处理WT幼苗4h（实验组），以及用DMSO处理4h（对照组）后样品进行qRT-PCR分析，相对基因表达量是表达NAC091在处理样品与未处理样品中表达量的差异。样品中NAC091表达量已通过Actin进行校正，**P<0.01，*P<0.05。3.2NAC091的诱导表达受到bZIP60的直接调控据目前已有的研究，在拟南芥中参与调控内质网未折叠应答途径中主要是bZIP28、bZIP60这两条信号转导通路；而且根据Sun、Yang等研究报道称NAC家族中NAC103、NAC062启动子序列上存在的TCATCG顺式元件能够与bZIP60结合，进一步说明bZIP类转录因子会参与调控NAC蛋白的表达。为了分析出NAC091的表达上调与bZIP28、bZIP60之间是否存在关联，本论文中用bzip28、bzip60单突变体(Sunetal.,2013)和WT野生型10d的幼苗，用5μg/mL的TM对以上3种不同的样品进行处理4h，并用DMSO处理的幼苗作为空白对照，然后
36分别对处理后的植株幼苗进行RNA的提取，并反转录成cDNA，再利用qRT-PCR分析这3种不同样品中NAC091的表达量。与对照进行比较，TM处理后在WT植株中NAC091的表达量上调约5倍；而TM处理后在bzip28单突变体植株中NAC091的表达量还是有所上调，只是其表达量与WT植株对比要低些，说明敲除bZIP28对NAC091的表达无影响，也进一步说NAC091的表达不受bZIP28调控；而在bzip60单突变体植株中，TM处理后NAC091的表达量不上调，且与DMSO对照组表达量相比毫无差异，说明NAC091在TM处理下，其表达受到bZIP60敲除的影响，也证实了NAC091的表达是依赖于bZIP60调控的（图3）；同时，对NAC091启动子序列进行比对，发现在该段序列上存在一个经典的ERSE-Ⅰ元件CGAAT…CACG（图4），以上实验充分说明了NAC091能够参与到内质网胁迫途径中来，并且受到bZIP60的调控。图3在内质网胁迫诱导下，WT、bzip28、bzip60中NAC091的表达用5μg/mL的TM（实验组）及相应浓度的DMSO（对照组）处理WT野生型、bzip28、bzip60单突变体幼苗4h，然后对处理后的幼苗进行RNA提娶逆转录成cDNA来进行qRT-PCR分析，相对基因表达量是不同样品中NAC091的表达差异。样品中NAC091表达量已通过Actin进行校正，**P<0.01，*P<0.05。图4NAC091启动子序列上存在ERSE-Ⅰ元件
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析[J]. 孙玲,王晓蕾,张宇飞,孙卫红,刘建祥,宋泽婷. 分子植物育种. 2018(05)
[2]植物内质网胁迫应答研究进展[J]. 杨正婷,刘建祥. 生物技术通报. 2016(10)
[3]中国南方喀斯特生态系统面临的问题及对策[J]. 熊康宁,池永宽. 生态经济. 2015(01)
[4]Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism[J]. Chang-Qing Yang 1,Xin Fang 1,Xiu-Ming Wu 1,Ying-Bo Mao 1,Ling-Jian Wang 1 and Xiao-Ya Chen 1,2 1 National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics,Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,the Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200032,China 2 Plant Science Research Center,Shanghai Chenshan Botanical Garden,Shanghai 201602,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2012(10)
[5]喀斯特脆弱生态系统复合退化控制与重建模式[J]. 彭晚霞,王克林,宋同清,曾馥平,王久荣. 生态学报. 2008(02)
[6]Transcriptional, post-transcriptional and post-translational regulations of gene expression during leaf polarity formation[J]. Lin Xu Li YangHai Huang National Laboratory of Plant Molecular Genetics, Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 300 Fenglin Road, Shanghai 200032, China. Cell Research. 2007(06)
[7]岩溶生态脆弱性研究[J]. 曾晓燕,牟瑞芳,许顺国. 环境科学与管理. 2006(01)
[8]贵州喀斯特石漠化地区土地利用方式对土壤质量恢复能力的影响[J]. 龙健,邓启琼,江新荣,李阳兵,姚斌. 生态学报. 2005(12)
[9]内质网相关蛋白的降解及其机制[J]. 齐静,彭建新. 细胞生物学杂志. 2004(02)
[10]我国西南岩溶地区土地石漠化研究[J]. 李林立,况明生,蒋勇军. 地域研究与开发. 2003(03)
本文编号：3262286
【文章来源】：贵州师范大学贵州省
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NAC蛋白的结构模式图(Ookaetal.,2003)
353.1NAC091在内质网胁迫诱导剂作用下表达上调TM、DTT是能够引起内质网发生胁迫的化学物质，通过添加其中的某一种来模拟内质网遭受胁迫的环境。为了判断NAC091是否会参与到内质网胁迫途径中？首先分别用TM(5μg/mL)和DTT(2mM)对生长10d的野生型拟南芥幼苗处理4h，并用DMSO处理的幼苗作为空白对照，然后分别对处理后的植株幼苗进行RNA的提取，并反转录成cDNA，利用qRT-PCR检测NAC091在不同处理下的表达差异（图2），与对照组(DMSO)相比较NAC091在TM和DTT处理4h的样品中，其表达量分别上调3.431和5.4倍，说明NAC091在内质网胁迫途径中表达量能够上调的。图2NAC091在内质网胁迫诱导剂处理下的表达分析用5μg/mL的TM和2mM的DTT处理WT幼苗4h（实验组），以及用DMSO处理4h（对照组）后样品进行qRT-PCR分析，相对基因表达量是表达NAC091在处理样品与未处理样品中表达量的差异。样品中NAC091表达量已通过Actin进行校正，**P<0.01，*P<0.05。3.2NAC091的诱导表达受到bZIP60的直接调控据目前已有的研究，在拟南芥中参与调控内质网未折叠应答途径中主要是bZIP28、bZIP60这两条信号转导通路；而且根据Sun、Yang等研究报道称NAC家族中NAC103、NAC062启动子序列上存在的TCATCG顺式元件能够与bZIP60结合，进一步说明bZIP类转录因子会参与调控NAC蛋白的表达。为了分析出NAC091的表达上调与bZIP28、bZIP60之间是否存在关联，本论文中用bzip28、bzip60单突变体(Sunetal.,2013)和WT野生型10d的幼苗，用5μg/mL的TM对以上3种不同的样品进行处理4h，并用DMSO处理的幼苗作为空白对照，然后
36分别对处理后的植株幼苗进行RNA的提取，并反转录成cDNA，再利用qRT-PCR分析这3种不同样品中NAC091的表达量。与对照进行比较，TM处理后在WT植株中NAC091的表达量上调约5倍；而TM处理后在bzip28单突变体植株中NAC091的表达量还是有所上调，只是其表达量与WT植株对比要低些，说明敲除bZIP28对NAC091的表达无影响，也进一步说NAC091的表达不受bZIP28调控；而在bzip60单突变体植株中，TM处理后NAC091的表达量不上调，且与DMSO对照组表达量相比毫无差异，说明NAC091在TM处理下，其表达受到bZIP60敲除的影响，也证实了NAC091的表达是依赖于bZIP60调控的（图3）；同时，对NAC091启动子序列进行比对，发现在该段序列上存在一个经典的ERSE-Ⅰ元件CGAAT…CACG（图4），以上实验充分说明了NAC091能够参与到内质网胁迫途径中来，并且受到bZIP60的调控。图3在内质网胁迫诱导下，WT、bzip28、bzip60中NAC091的表达用5μg/mL的TM（实验组）及相应浓度的DMSO（对照组）处理WT野生型、bzip28、bzip60单突变体幼苗4h，然后对处理后的幼苗进行RNA提娶逆转录成cDNA来进行qRT-PCR分析，相对基因表达量是不同样品中NAC091的表达差异。样品中NAC091表达量已通过Actin进行校正，**P<0.01，*P<0.05。图4NAC091启动子序列上存在ERSE-Ⅰ元件
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析[J]. 孙玲,王晓蕾,张宇飞,孙卫红,刘建祥,宋泽婷. 分子植物育种. 2018(05)
[2]植物内质网胁迫应答研究进展[J]. 杨正婷,刘建祥. 生物技术通报. 2016(10)
[3]中国南方喀斯特生态系统面临的问题及对策[J]. 熊康宁,池永宽. 生态经济. 2015(01)
[4]Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism[J]. Chang-Qing Yang 1,Xin Fang 1,Xiu-Ming Wu 1,Ying-Bo Mao 1,Ling-Jian Wang 1 and Xiao-Ya Chen 1,2 1 National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics,Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,the Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200032,China 2 Plant Science Research Center,Shanghai Chenshan Botanical Garden,Shanghai 201602,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2012(10)
[5]喀斯特脆弱生态系统复合退化控制与重建模式[J]. 彭晚霞,王克林,宋同清,曾馥平,王久荣. 生态学报. 2008(02)
[6]Transcriptional, post-transcriptional and post-translational regulations of gene expression during leaf polarity formation[J]. Lin Xu Li YangHai Huang National Laboratory of Plant Molecular Genetics, Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 300 Fenglin Road, Shanghai 200032, China. Cell Research. 2007(06)
[7]岩溶生态脆弱性研究[J]. 曾晓燕,牟瑞芳,许顺国. 环境科学与管理. 2006(01)
[8]贵州喀斯特石漠化地区土地利用方式对土壤质量恢复能力的影响[J]. 龙健,邓启琼,江新荣,李阳兵,姚斌. 生态学报. 2005(12)
[9]内质网相关蛋白的降解及其机制[J]. 齐静,彭建新. 细胞生物学杂志. 2004(02)
[10]我国西南岩溶地区土地石漠化研究[J]. 李林立,况明生,蒋勇军. 地域研究与开发. 2003(03)
本文编号：3262286
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