小窝蛋白-1在EMCV感染宿主细胞内吞途径中作用的研究
发布时间：2021-07-20 01:38
为了检测EMCV是否通过内吞途径感染宿主细胞,本研究使用内吞途径抑制剂作用于BHK-21细胞后进行EMCV攻毒,通过病毒滴度、病毒拷贝数和病毒结构蛋白VP1的检测发现EMCV的感染受到抑制,提示EMCV可通过内吞途径感染BHK-21细胞。然后在EMCV感染BHK-21细胞的过程中对内吞途径标志蛋白EEA1和病毒结构蛋白VP1进行定位检测,发现二者在病毒感染细胞过程中共定位现象明显,证明EMCV可通过内吞途径感染BHK-21细胞。为了确定EMCV具体通过何种内吞途径感染宿主细胞,分别使用多种内吞途径抑制剂作用于BHK-21细胞后进行EMCV攻毒,检测EMCV对细胞的感染是否受到影响以确定EMCV通过何种内吞途径感染宿主细胞。结果提示EMCV不通过Clathrin依赖型内吞途径和巨胞饮途径感染细胞,但通过Caveolin依赖型内吞途径感染BHK-21细胞。然后又检测了两种对Caveolin依赖型内吞途径至关重要的蛋白——肌动蛋白（Actin）和发动蛋白（Dynamin）对EMCV感染BHK-21细胞的影响,结果提示肌动蛋白和发动蛋白同样影响EMCV感染BHK-21细胞。最后进行细胞接毒之后...
【文章来源】：西北民族大学甘肃省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞内吞途径[97]
19为极显著，图中显示为***。3结果3.1抑制剂适宜浓度筛选筛选不影响细胞活力的8种抑制剂适宜工作浓度如图1所示：内吞途径抑制剂NH4Cl的适宜工作浓度为10mM和20mM，bafilomycinA1为10nM和20nM；Clathrin依赖型内吞途径抑制剂Chlorpromazine的适宜工作浓度为5μM和10μM，Pitstop为5μM和10μM；Caveolin依赖型内吞途径抑制剂nystatin的适宜工作浓度为12.5μg/mL和25μg/mL，MβCD为2.5mM和5mM；发动蛋白抑制剂dynasore的适宜工作浓度为20μM和40μM，mitmab为5μM和10μM；肌动蛋白抑制剂CytochalasinD的适宜工作浓度为5μM和10μM，Jasplakinolide为5μM和10μM；巨胞饮途径抑制剂IPA-3的适宜工作浓度为7.5μM和15μM，wortmannin为5μM和10μM。图1抑制剂浓度筛选
21图2内吞途径抑制剂作用于BHK-细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.2TheimpactofEMCVinfectBHK-21cellsdealtwithendocyticpathwayinhibitorA:NH4Cl作用下VP1蛋白检测；B:NH4Cl作用下病毒滴度检测；C:NH4Cl作用下病毒拷贝数检测；D:bafilomycinA1作用下VP1蛋白检测；E:bafilomycinA1作用下病毒滴度检测；F:bafilomycinA1作用下病毒拷贝数检测；ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001。A:VP1proteindetectionafterdealwithNH4Cl;B:VirustiterdetectionafterdealwithNH4Cl;C:ViruscopiesdetectionafterdealwithNH4Cl;D:VP1proteindetectionafterdealwithbafmycinA1;E:VirustiterdetectionafterdealwithbafilomycinA1;F:ViruscopiesdetectionafterdealwithbafilomycinA1;ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001.3.3内吞标志蛋白EEA1与EMCVVP1定位检测在EMCV感染BHK-21细胞的过程中用免疫荧光法对EMCV的结构蛋白VP1和内吞途径标志性蛋白EEA1染色，于共聚焦显微镜下观察EMCVVP1和EEA1的定位结果如图3所示，病毒粒子VP1蛋白呈现明显绿色，EEA1呈现明显红色，细胞核呈现蓝色；在Merge图中可以看出EMCV和EEA1在核周围有明显的橘黄色共定位区域。
本文编号：3291854
【文章来源】：西北民族大学甘肃省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细胞内吞途径[97]
19为极显著，图中显示为***。3结果3.1抑制剂适宜浓度筛选筛选不影响细胞活力的8种抑制剂适宜工作浓度如图1所示：内吞途径抑制剂NH4Cl的适宜工作浓度为10mM和20mM，bafilomycinA1为10nM和20nM；Clathrin依赖型内吞途径抑制剂Chlorpromazine的适宜工作浓度为5μM和10μM，Pitstop为5μM和10μM；Caveolin依赖型内吞途径抑制剂nystatin的适宜工作浓度为12.5μg/mL和25μg/mL，MβCD为2.5mM和5mM；发动蛋白抑制剂dynasore的适宜工作浓度为20μM和40μM，mitmab为5μM和10μM；肌动蛋白抑制剂CytochalasinD的适宜工作浓度为5μM和10μM，Jasplakinolide为5μM和10μM；巨胞饮途径抑制剂IPA-3的适宜工作浓度为7.5μM和15μM，wortmannin为5μM和10μM。图1抑制剂浓度筛选
21图2内吞途径抑制剂作用于BHK-细胞对EMCV感染细胞的影响Fig.2TheimpactofEMCVinfectBHK-21cellsdealtwithendocyticpathwayinhibitorA:NH4Cl作用下VP1蛋白检测；B:NH4Cl作用下病毒滴度检测；C:NH4Cl作用下病毒拷贝数检测；D:bafilomycinA1作用下VP1蛋白检测；E:bafilomycinA1作用下病毒滴度检测；F:bafilomycinA1作用下病毒拷贝数检测；ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001。A:VP1proteindetectionafterdealwithNH4Cl;B:VirustiterdetectionafterdealwithNH4Cl;C:ViruscopiesdetectionafterdealwithNH4Cl;D:VP1proteindetectionafterdealwithbafmycinA1;E:VirustiterdetectionafterdealwithbafilomycinA1;F:ViruscopiesdetectionafterdealwithbafilomycinA1;ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001.3.3内吞标志蛋白EEA1与EMCVVP1定位检测在EMCV感染BHK-21细胞的过程中用免疫荧光法对EMCV的结构蛋白VP1和内吞途径标志性蛋白EEA1染色，于共聚焦显微镜下观察EMCVVP1和EEA1的定位结果如图3所示，病毒粒子VP1蛋白呈现明显绿色，EEA1呈现明显红色，细胞核呈现蓝色；在Merge图中可以看出EMCV和EEA1在核周围有明显的橘黄色共定位区域。
本文编号：3291854
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