猪流行性腹泻病毒基因工程灭活疫苗的免疫试验研究
发布时间：2021-07-23 15:51
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是世界范围内导致猪只产生腹泻的主要病原体之一,尤其近十年来PEDV造成了养猪行业巨大的经济损失。PEDV对各个年龄段的猪均有很高的感染率,能够引起猪只产生腹泻、脱水等症状,尤其能够引起7日龄以下的仔猪高发病率以及高死亡率。目前对PEDV防控最有效的方式是疫苗免疫,免疫形式包括主动免疫和被动免疫。对成年猪防控PEDV的措施主要为主动免疫,对幼龄仔猪防控PEDV的方式主要为被动免疫。因此,本研究以30日龄仔猪作为研究对象,通过实验猪的主动免疫效果来筛选重组灭活疫苗佐剂的种类,探索灭活疫苗的注射剂量;以妊娠母猪及其所产仔猪作为研究对象,初步探究PEDV 15A灭活疫苗的被动免疫效果。有效的疫苗免疫后可以诱导机体产生特异性的抗体,为能够监测实验室的新型重组疫苗诱导动物机体产生特异性IgG抗体的水平,本研究首先建立了检测PEDV IgG抗体的间接ELISA方法。以原核表达并纯化的PEDV S1蛋白片段（139aa）作为包被抗原,以羊抗猪IgG-HRP作为二抗,将每步反应程序优化并进行特异性、敏感性以及重复性试验。特异性试验显示该方法对TGEV、PoRV和PDCoV常见...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV模式图和基因组结构
猪流行性腹泻病毒基因工程灭活疫苗的免疫试验研究18立阴性、阳性对照）37℃孵育45min，然后用PBST洗涤4次，每次洗涤后拍干，最后甩干备用。（4）二抗孵育：将酶标二抗用PBS按1：15000稀释混匀后，每孔加入100μL稀释二抗，37℃孵育30min，后用PBST洗涤4次，每次洗涤后拍干，最后甩干备用。（5）显色：将商品化的TMB显色液按照每孔100μL加入到ELISA反应板中，室温避光显色10min。（6）终止反应并读数：每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪读取在OD450nm的值。当OD值大于0.66时判定为阳性样品。2.3.2间接ELISA结果阴阳性临界值的判定根据统计学原理，当OD450nm＞x＋3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。经计算75份阴性血清的平均值（x）为0.225，标准方差SD为0.145，根据公式：阴、阳性血清临界值＝OD450nm平均值（x）+3×SD=0.225+3*0.145=0.66，因此，当待检血清OD450nm≥0.66时即可判为阳性，反之判为阴性。（详细结果见附录表28）。2.3.3交叉性实验按上述优化后的间接ELISA方法对猪德尔塔冠状病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、阳性血清进行检测，以PEDV阴阳性血清做对照，在酶标仪OD450波长下读出值（图2），可以看到上述血清OD值低于阳性标准（0.66），说明以S417为包被蛋白建立的间接ELISA方法与其它病毒血清无交叉反应性。图2交叉反应实验结果Fig.2Cross-reactionexperimentresults
猪流行性腹泻病毒基因工程灭活疫苗的免疫试验研究24显色：将商品化的TMB显色液按照每孔100μL加入到ELISA反应板中，室温避光显色10min。终止反应并读数：每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪读取OD450nm值。当OD值大于0.66判定为阳性样品。3.1.3结果3.1.3.1商品化试剂盒IgG抗体水平检测结果使用购买的商品化试剂盒对各组各时间点共计189份血清样品进行检测，共有5只实验猪共计12份样品抗体呈阳性过（试剂盒阳性判定标准S/P值＞0.35），结果见附录表29。按组求平均值后作图可见，在首免后，各组抗体水平都呈上升趋势，但是只有D组抗体水平达到了阳性，C组虽然上升趋势很明显，但是距离阳性临界值还有一定距离。D组15A佐剂配制的灭活苗产生了较好的主动免疫效果，抗体水平达到了一个比较高的值，并在比较高的水平下持续到8W，见图3。图3商品化试剂盒检测不同佐剂组IgG抗体水平Fig.3CommercialkitswereusedtodetectIgGantibodylevelsindifferentadjuvantgroups3.1.3.2自己包被试剂盒抗体水平检测结果使用S417试剂盒对各组各时间点共计189份血清样品进行重复检测，共有4只实
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒S1蛋白B细胞表位原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 陈金龙,许可军,李芬,刘通,于智慧,刘晓萌,董林,魏凤,沈志强,许崇友,王金良. 中国兽医学报. 2018(12)
[2]基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 张琪,徐丽美,周宏超,杨猛超,张淼涛,于三科,许信刚. 中国兽医科学. 2018(02)
[3]PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立[J]. 郑逢梅,赵军,霍金耀,李欢,杨霞,陈陆,常洪涛,王新卫,刘红英,杜季梅,姚慧霞,王川庆. 中国兽医学报. 2014(03)
[4]基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立[J]. 邓祖丽颖. 河南农业科学. 2013(08)
[5]应用逆转录套式PCR检测猪流行性腹泻病毒[J]. 王金良,谢金文,唐娜,祖立闯,李娇,汪洋,沈志强. 中国畜牧兽医. 2012(09)
[6]猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究[J]. 吴学敏,陈如敬,王隆柏,车勇良,刘玉涛,庄向生,严山,周伦江. 中国农学通报. 2012(26)
[7]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[8]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经. 生物工程学报. 2009(06)
[9]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[10]表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 董丽娜,高凤山,许崇波,胡桂学,姜海龙. 畜牧兽医学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救[D]. 陈冰清.东华大学 2015
本文编号：3299584
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV模式图和基因组结构
猪流行性腹泻病毒基因工程灭活疫苗的免疫试验研究18立阴性、阳性对照）37℃孵育45min，然后用PBST洗涤4次，每次洗涤后拍干，最后甩干备用。（4）二抗孵育：将酶标二抗用PBS按1：15000稀释混匀后，每孔加入100μL稀释二抗，37℃孵育30min，后用PBST洗涤4次，每次洗涤后拍干，最后甩干备用。（5）显色：将商品化的TMB显色液按照每孔100μL加入到ELISA反应板中，室温避光显色10min。（6）终止反应并读数：每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪读取在OD450nm的值。当OD值大于0.66时判定为阳性样品。2.3.2间接ELISA结果阴阳性临界值的判定根据统计学原理，当OD450nm＞x＋3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。经计算75份阴性血清的平均值（x）为0.225，标准方差SD为0.145，根据公式：阴、阳性血清临界值＝OD450nm平均值（x）+3×SD=0.225+3*0.145=0.66，因此，当待检血清OD450nm≥0.66时即可判为阳性，反之判为阴性。（详细结果见附录表28）。2.3.3交叉性实验按上述优化后的间接ELISA方法对猪德尔塔冠状病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、阳性血清进行检测，以PEDV阴阳性血清做对照，在酶标仪OD450波长下读出值（图2），可以看到上述血清OD值低于阳性标准（0.66），说明以S417为包被蛋白建立的间接ELISA方法与其它病毒血清无交叉反应性。图2交叉反应实验结果Fig.2Cross-reactionexperimentresults
猪流行性腹泻病毒基因工程灭活疫苗的免疫试验研究24显色：将商品化的TMB显色液按照每孔100μL加入到ELISA反应板中，室温避光显色10min。终止反应并读数：每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪读取OD450nm值。当OD值大于0.66判定为阳性样品。3.1.3结果3.1.3.1商品化试剂盒IgG抗体水平检测结果使用购买的商品化试剂盒对各组各时间点共计189份血清样品进行检测，共有5只实验猪共计12份样品抗体呈阳性过（试剂盒阳性判定标准S/P值＞0.35），结果见附录表29。按组求平均值后作图可见，在首免后，各组抗体水平都呈上升趋势，但是只有D组抗体水平达到了阳性，C组虽然上升趋势很明显，但是距离阳性临界值还有一定距离。D组15A佐剂配制的灭活苗产生了较好的主动免疫效果，抗体水平达到了一个比较高的值，并在比较高的水平下持续到8W，见图3。图3商品化试剂盒检测不同佐剂组IgG抗体水平Fig.3CommercialkitswereusedtodetectIgGantibodylevelsindifferentadjuvantgroups3.1.3.2自己包被试剂盒抗体水平检测结果使用S417试剂盒对各组各时间点共计189份血清样品进行重复检测，共有4只实
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒S1蛋白B细胞表位原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 陈金龙,许可军,李芬,刘通,于智慧,刘晓萌,董林,魏凤,沈志强,许崇友,王金良. 中国兽医学报. 2018(12)
[2]基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 张琪,徐丽美,周宏超,杨猛超,张淼涛,于三科,许信刚. 中国兽医科学. 2018(02)
[3]PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立[J]. 郑逢梅,赵军,霍金耀,李欢,杨霞,陈陆,常洪涛,王新卫,刘红英,杜季梅,姚慧霞,王川庆. 中国兽医学报. 2014(03)
[4]基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立[J]. 邓祖丽颖. 河南农业科学. 2013(08)
[5]应用逆转录套式PCR检测猪流行性腹泻病毒[J]. 王金良,谢金文,唐娜,祖立闯,李娇,汪洋,沈志强. 中国畜牧兽医. 2012(09)
[6]猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究[J]. 吴学敏,陈如敬,王隆柏,车勇良,刘玉涛,庄向生,严山,周伦江. 中国农学通报. 2012(26)
[7]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[8]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经. 生物工程学报. 2009(06)
[9]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[10]表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 董丽娜,高凤山,许崇波,胡桂学,姜海龙. 畜牧兽医学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救[D]. 陈冰清.东华大学 2015
本文编号：3299584
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