植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的原核表达及其酶学性质研究
发布时间：2021-08-17 23:59
γ-氨基丁酸（GABA）是一种抑制性神经递质,具有一系列重要的生理功能。GABA作为一种功能性食品保健因子其制备和应用一直备受人们关注。谷氨酸脱羧酶（GAD）是生物催化生产GABA的关键限速酶。GABA的传统发酵法产量较低,不适合GABA的规模化生产,利用GAD通过体外催化合成GABA是一种简单经济的生产方式。为了获取GABA生产所必需的GAD,本研究构建了一株重组工程菌E.coli BL21-pGEX-4T-gadB,经表达纯化获得高活力GAD,并对其酶学性质进行了研究。主要研究内容和结果如下:1.以植物乳杆菌L.plantarumQL-14基因组序列为模版,设计了一对特异性引物并扩增谷氨酸脱羧酶编码基因gadB,将其连接至融合表达载体pGEX-4T-3构建重组质粒pGEX-4T-gadB并转化至E.coli BL21构建大肠杆菌原核表达系统。测序结果显示谷氨酸脱羧酶编码基因gadB与GeneBank上已发表的植物乳杆菌L.plantarum WCFS1中gad基因序列同源性最高相似度为99.6%。2.利用生物信息学分析方法对克隆GAD进行序列及结构分析,发现gadB基因ORF全长1...
【文章来源】：广西科技大学广西壮族自治区
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 γ-氨基丁酸（GABA）概述
1.1.1 GABA及其结构特性
1.1.2 GABA的生理功能
1.1.3 GABA的应用
1.1.4 GABA的制备方法
1.1.5 GABA测定方法
1.2 谷氨酸脱羧酶（GAD）
1.2.1 谷氨酸脱羧酶概述
1.2.2 动物GAD
1.2.3 植物GAD
1.2.4 微生物GAD
1.2.5 微生物GAD在代谢途径中的作用
1.2.6 GAD分子生物学研究
1.3 本研究目的意义及研究内容
1.3.1 本研究目的及主要内容
1.3.2 创新点
第二章 gadB基因的克隆及重组表达工程菌的构建
2.1 实验材料
2.1.1 菌种及载体
2.1.2 培养基及主要试剂
2.1.3 引物合成及测序
2.1.4 主要酶制剂和试剂盒
2.1.5 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 E.coli BL21感受态细胞的制备及转化
2.2.2 gadB基因的克隆
2.2.3 重组表达工程菌的构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 目的基因PCR扩增
2.3.2 TA克隆结果的验证
2.3.3 目的基因连接至表达载体
2.3.4 重组表达质粒的验证
2.4 本章小结
第三章 重组GAD序列及其结构分析
3.1 实验材料
3.1.1 材料
3.1.2 主要数据库及软件
3.2 实验方法
3.2.1 GAD序列及结构域分析
3.2.2 GAD的基本信息分析
3.2.3 GAD二级结构预测
3.2.4 GAD三级结构预测
3.2.5 多重序列比对
3.2.6 系统进化树的构建
3.3 结果与讨论
3.3.1 GAD序列和结构域分析
3.3.2 重组GAD氨基酸组成及其理化性质
3.3.3 疏水性结构分析
3.3.4 二级结构分析
3.3.5 三级结构预测
3.3.6 多重序列比对
3.3.7 系统进化树的构建
3.4 本章小结
第四章 重组GAD表达纯化及其活力分析
4.1 实验材料
4.1.1 菌种
4.1.2 主要试剂及其配制方法
4.1.3 主要药品和试剂
4.1.4 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 重组蛋白的诱导表达
4.2.2 重组蛋白的表达条件优化
4.2.3 融合蛋白可溶性验证
4.2.4 目的蛋白的分离纯化
4.2.5 纯化目的蛋白GAD浓度的测定
4.2.6 重组GAD活力测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 重组蛋白的诱导表达
4.3.2 表达条件优化
4.3.3 融合蛋白的可溶性分析
4.3.4 目的蛋白的分离纯化
4.3.5 重组GAD活力分析
4.4 本章小结
第五章 重组GAD酶学性质研究
5.1 实验材料
5.1.1 菌种与培养基
5.1.2 主要药品及仪器
5.1.3 主要试剂的配制方法
5.2 实验方法
5.2.1 最适pH的确定及pH稳定性
5.2.2 最适反应温度的确定及温度稳定性
5.2.3 辅酶PLP浓度对酶活力的影响
5.2.4 金属离子及EDTA对酶活的影响
5.2.5 表面活性剂对酶活力的影响
5.2.6 有机溶剂对酶活力的影响
5.2.7 米氏常数的确定
5.3 结果与讨论
5.3.1 最适pH的确定及pH稳定性
5.3.2 最适反应温度及温度稳定性
5.3.3 辅酶PLP浓度对酶活力的影响
5.3.4 不同金属离子及EDTA对酶活的影响
5.3.5 表面活性剂对酶活力的影响
5.3.6 有机溶剂对酶活力的影响
5.3.7 米氏常数
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
致谢
本文编号：3348770
【文章来源】：广西科技大学广西壮族自治区
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 γ-氨基丁酸（GABA）概述
1.1.1 GABA及其结构特性
1.1.2 GABA的生理功能
1.1.3 GABA的应用
1.1.4 GABA的制备方法
1.1.5 GABA测定方法
1.2 谷氨酸脱羧酶（GAD）
1.2.1 谷氨酸脱羧酶概述
1.2.2 动物GAD
1.2.3 植物GAD
1.2.4 微生物GAD
1.2.5 微生物GAD在代谢途径中的作用
1.2.6 GAD分子生物学研究
1.3 本研究目的意义及研究内容
1.3.1 本研究目的及主要内容
1.3.2 创新点
第二章 gadB基因的克隆及重组表达工程菌的构建
2.1 实验材料
2.1.1 菌种及载体
2.1.2 培养基及主要试剂
2.1.3 引物合成及测序
2.1.4 主要酶制剂和试剂盒
2.1.5 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 E.coli BL21感受态细胞的制备及转化
2.2.2 gadB基因的克隆
2.2.3 重组表达工程菌的构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 目的基因PCR扩增
2.3.2 TA克隆结果的验证
2.3.3 目的基因连接至表达载体
2.3.4 重组表达质粒的验证
2.4 本章小结
第三章 重组GAD序列及其结构分析
3.1 实验材料
3.1.1 材料
3.1.2 主要数据库及软件
3.2 实验方法
3.2.1 GAD序列及结构域分析
3.2.2 GAD的基本信息分析
3.2.3 GAD二级结构预测
3.2.4 GAD三级结构预测
3.2.5 多重序列比对
3.2.6 系统进化树的构建
3.3 结果与讨论
3.3.1 GAD序列和结构域分析
3.3.2 重组GAD氨基酸组成及其理化性质
3.3.3 疏水性结构分析
3.3.4 二级结构分析
3.3.5 三级结构预测
3.3.6 多重序列比对
3.3.7 系统进化树的构建
3.4 本章小结
第四章 重组GAD表达纯化及其活力分析
4.1 实验材料
4.1.1 菌种
4.1.2 主要试剂及其配制方法
4.1.3 主要药品和试剂
4.1.4 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 重组蛋白的诱导表达
4.2.2 重组蛋白的表达条件优化
4.2.3 融合蛋白可溶性验证
4.2.4 目的蛋白的分离纯化
4.2.5 纯化目的蛋白GAD浓度的测定
4.2.6 重组GAD活力测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 重组蛋白的诱导表达
4.3.2 表达条件优化
4.3.3 融合蛋白的可溶性分析
4.3.4 目的蛋白的分离纯化
4.3.5 重组GAD活力分析
4.4 本章小结
第五章 重组GAD酶学性质研究
5.1 实验材料
5.1.1 菌种与培养基
5.1.2 主要药品及仪器
5.1.3 主要试剂的配制方法
5.2 实验方法
5.2.1 最适pH的确定及pH稳定性
5.2.2 最适反应温度的确定及温度稳定性
5.2.3 辅酶PLP浓度对酶活力的影响
5.2.4 金属离子及EDTA对酶活的影响
5.2.5 表面活性剂对酶活力的影响
5.2.6 有机溶剂对酶活力的影响
5.2.7 米氏常数的确定
5.3 结果与讨论
5.3.1 最适pH的确定及pH稳定性
5.3.2 最适反应温度及温度稳定性
5.3.3 辅酶PLP浓度对酶活力的影响
5.3.4 不同金属离子及EDTA对酶活的影响
5.3.5 表面活性剂对酶活力的影响
5.3.6 有机溶剂对酶活力的影响
5.3.7 米氏常数
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
致谢
本文编号：3348770
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