猪环曲病毒检测方法的建立及四川省分子流行病学调查

发布时间：2017-05-01 13:02

  本文关键词：猪环曲病毒检测方法的建立及四川省分子流行病学调查，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪环曲病毒(Porcine Torovirus, PToV)为一种单股正链的RNA病毒,是套式病毒目(Nidovirales),冠状病毒科(Coronaviridae),凸隆病毒属成员之一。1992年,首次在南非报道的猪腹泻粪便样品中分离得到类似BRV病毒的粒子,即猪环曲病毒。随后,PToV在荷兰、西班牙、加拿大、匈牙利、美国和英格兰等国家被相继报道。PToV在世界范围内的广泛分布以及在腹泻样品中的高检出率,使大部分学者认为其极大可能也是一种猪腹泻的病原。虽然猪环曲病毒的感染主要引起一些亚临床症状,但它仍然是一种存在潜在威胁的病毒,可能与其它腹泻病毒共同存在,加重并且恶化感染猪腹泻病情的发展情况。由于目前该病毒尚不能被分离纯化,在各方面限制了对其的进一步研究以及探索。对于该病毒结构和功能、发病机理、致病性等多方面还存在许多问题尚未得到解决,需要更多进一步的研究来阐明其病原特性及生物学特性。本研究建立了两种猪环曲病毒检测方法,再选择其中最适合大规模检测的方法作为四川地区猪环曲病毒流行情况调查的检测手段,并对猪环曲病毒四川株M全基因分子流行病学特点进行分析；根据GenBank登录的PToV S基因与N基因序列,利用Primer 5.0软件分别设计合成两对特异性引物,预计扩增片段大小为451bp和258bp。随后,在此基础上,经过相关一系列的条件优化,成功建立了该病毒的RT-PCR以及荧光定量RT-PCR检测方法。两种方法的特异性以及重复性实验表现较好,两者的灵敏度分别为10-5和10-。虽然实时荧光定量RT-PCR方法比常规PCR方法更加灵敏,但经过各方面评估后,确定常规PCR检测方法更适合作为分子流行病学调查的检测手段。本研究从2011-2013年期间的四川各地区猪场送检872份腹泻猪粪便以及肠道组织的样品,将这些样品分为四个类别：1-3周龄,3-7周龄,7-11周龄及超过11周龄猪,利用RT-PCR方法对样品进行检测,猪环曲病毒的总阳性率为37.96%(331/872)。再利用RT-PCR扩增猪环曲病毒M基因序列,通过分子克隆,测序得到19个猪环曲病毒M基因序列(GenBank登录号：KF727566-KF727584.),核苷酸序列相似性为97.3-99.9%,氨基酸序列相似性为99.1-99.6%。利用序列分析软件MEGA 5.0对猪环曲病毒M基因序列进行系统进化分析,结果显示本研究获得的四川株猪环曲病毒与两株韩国株分属于一个大的分支,说明了猪环曲病毒M基因序列的高度保守性。其与韩国株在进化上比较接近,又说明目前我国PToV的流行毒株比较稳定,没有发生大的基因变异。
【关键词】：猪环曲病毒 RT-PCR 荧光定量RT-PCR 分子流行病学调查
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 常用缩略词表8-13
• 文献综述13-21
• 1 PToV的发现13-15
• 2 PToV基因组结构及特点15-17
• 3 PToV生物学特性17
• 4 PToV检测方法17-18
• 5 PToV流行病学18-19
• 6 前景展望19-21
• 第一章 猪环曲病毒检测方法的建立21-39
• 1 实验材料21-23
• 1.1 病毒与细菌21
• 1.2 临床样品21-22
• 1.3 主要试剂和仪器22
• 1.4 溶液配制22-23
• 2 实验方法23-28
• 2.1 猪环曲病毒RT-PCR检测方法的建立23-26
• 2.1.1 引物设计与合成23
• 2.1.2 病毒RNA提取及反转录23
• 2.1.3 PCR扩增23-24
• 2.1.4 RT-PCR产物的回收24
• 2.1.5 感受态细胞的制备24-25
• 2.1.6 目的片段的克隆25
• 2.1.7 目的片段的测序25-26
• 2.1.8 特异性实验26
• 2.1.9 敏感性实验26
• 2.1.10 重复性实验26
• 2.1.11 临床样品检测26
• 2.2 猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立26-28
• 2.2.1. 病毒核酸的提取26
• 2.2.2 荧光定量引物设计26-27
• 2.2.3 阳性标准品的制备27
• 2.2.4 反应条件的优化27
• 2.2.5 标准曲线建立27-28
• 2.2.6 特异性检测28
• 2.2.7 可重复性及再现性评估28
• 2.2.8 实时荧光RT-PCR和已建立常规的PCR灵敏度比较28
• 2.2.9 建立实时荧光RT-PCR对临床样品的检测28
• 2.2.10 实时荧光RT-PCR与已建立常规的PCR选择28
• 3 结果28-35
• 3.1 猪环曲病毒RT-PCR检测方法结果28-32
• 3.1.1 RT-PCR扩增产物电泳结果28-29
• 3.1.2 目的片段克隆测序与序列分析29
• 3.1.3 特异性实验结果29-30
• 3.1.4 敏感性实验结果30-31
• 3.1.5 重复性实验结果31
• 3.1.6 临床样品检测结果31-32
• 3.2 猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法结果32-35
• 3.2.1 优化的Real Time RT-PCR检测条件32
• 3.2.2 PToV实时荧光RT-PCR敏感性32-33
• 3.2.3 Real Time RT-PCR标准曲线33-34
• 3.2.4 融解曲线和特异性分析34
• 3.2.5 重复性与再现性34-35
• 3.2.6 建立的RRT-PCR方法对临床样品的检测35
• 3.2.7 实时荧光RT-PCR与已建立常规的PCR的选择35
• 4 讨论35-38
• 4.1 RT-PCR检测方法35-36
• 4.2 RRT-PCR检测方法36-38
• 5 小结38-39
• 第二章 四川省2011-2013年猪环曲病毒流行病学调查39-54
• 1 实验材料39
• 1.1 样品收集及分类39
• 2 实验方法39-42
• 2.1 引物设计与合成39-40
• 2.2 RNA的提取及RT-PCR的扩增40-41
• 2.3 PToV M基因的扩增,克隆及测序41-42
• 2.4 PToV M基因的序列分析及系统发育树的绘制42
• 3 结果42-51
• 3.1 PToV采集区域图42
• 3.2 不同猪群PToV感染率42-43
• 3.3 不同地区PToV感染率43-44
• 3.4 混合感染检测结果44-45
• 3.5 进化树的建立45-47
• 3.6 M基因的同源性比对47-50
• 3.7 基因突变分析50-51
• 4 讨论51-53
• 4.1 流行病学51-52
• 4.2 进化分析52-53
• 5. 小结53-54
• 全文结论54-55
• 参考文献55-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文61

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