肠道微生物功能研究中无菌斑马鱼模型的优化及高通量测序平台的比较
发布时间：2021-10-20 08:00
脊椎动物消化道内栖息着不计其数的共生微生物,它们也被称为是宿主的一个非常重要的“器官”。肠道微生物在宿主的营养与能量代谢、免疫调控、生长发育等方面扮演着重要的角色,肠道菌群的组成与宿主健康息息相关。无菌动物模型和微生物测序技术是目前探索动物体肠道微生物功能及其与宿主相互关系的两大关键技术平台,但是这两项技术在实践操作中面临一些挑战:一是无菌动物模型接种条件如何确定?二是如何选择多样的测序平台以及如何确认测序数据可以反映微生物的功能?针对以上两个问题,本论文进行如下两方面的探索:1.无菌斑马鱼接种条件的优化无菌动物技术的出现使人类对肠道微生物的探索进入了功能研究时代。相对于目前应用较多的无菌小鼠模型,无菌斑马鱼因其繁殖能力强、饲养成本低、无菌操作便捷等独特的优势正逐渐成为肠道微生物功能探索的主力军。将某种/些微生物接种于无菌斑马鱼中,有助于研究者探讨微生物对宿主的营养、免疫、运动、神经发育等方面的调节作用。在接种过程中的接种条件包括接种时间、接种浓度和微生物暴露时间等都可能影响最终的研究结果,然而,目前研究中的无菌斑马鱼微生物接种条件多种多样,如何确定最佳接种条件仍不清楚,这也极大地限制...
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无菌斑马鱼制作流程[64]
华东师范大学硕士学位论文13图2-1.pET-28a(+)质粒信息Fig2-1.TheinformationofpET-28a(+)plasmid.枯草芽孢杆菌WB800N的荧光标记选用了包含有EGFP基因和氯霉素抗性基因的pHT01质粒(BioVectorNTCCInc,Beijing,China，图2-2）。添加5ug/mL氯霉素(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)在37°C170rpm/分钟下培养菌液24h,当细菌的OD600达到0.6-0.8时，添加1μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(SigmaChemicalCo.St.Louis,MO,USA)继续培养1-2小时来诱导枯草芽孢杆菌内绿色荧光蛋白的表达。图2-2.pHT01(+)质粒信息Fig2-2.TheinformationofpHT01(+)plasmid.分别取1mL大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养液置于1.5mLEP管中1000rpm/分钟离心1分钟，待菌体沉淀于EP管底部，置于荧光显微镜下检测(SZX16,Olympus,Tokyo,Japan)。1.2.2无菌斑马鱼的制备无菌斑马鱼的制备流程在先前工作的基础上稍加改造[94]，已经在第一章第二节内详细记述。1.2.3无菌斑马鱼的单一接种将两株菌的培养液分别以7500rpm离心10分钟，将上清液从培养基中除去。继而将菌体沉淀继续在无菌水中洗涤三次，然后用无菌的GZM重悬菌体，
华东师范大学硕士学位论文14以102CFU/mL至107CFU/mL的最终浓度转移到GF斑马鱼培养基中。用无菌吸管将受精后3天（3daypostfertilization3dpf）和5dpf的GF斑马鱼幼仔分别转入6孔无菌平板(每孔10条)。无菌斑马鱼幼鱼一共分为两组：无菌斑马鱼组与单一接种组。无菌斑马鱼的单一接种是将无菌斑马鱼幼鱼暴露在浓度为102-107CFU/mL的大肠杆菌DH5α或浓度为102-106CFU/mL的枯草芽孢杆菌WB800N溶液中,并且将其置于28°C的培养箱内培养24小时或48小时。暴露于102CFU/mL到107CFU/mL大肠杆菌的斑马鱼组分别定义为2E、3E、4E、5E、6E、7E组，暴露于102CFU/mL到106CFU/mL枯草芽孢杆菌的斑马鱼组分别定义为2B、3B、4B、5B、6B组。无菌组简称为GF，正常饲养的斑马鱼简称为CONR，实验设计如图2-3。图2-3.实验设计Fig.2-3Thedesignofexperiments.1.2.4细菌定植浓度的检测斑马鱼在不同浓度的两种细菌中分别暴露24h和48h以后，为了量化每条鱼肠道内的定植菌数，将10只斑马鱼幼鱼移入1.5mL无菌试管中，用无菌水冲洗10次，去除附着于表面的细菌。随后，加入无菌玻璃珠(600mm)和500mL高压灭菌的PBS(1x)，使用震荡仪(BIO101/FP120QBioGene)在60Hz的频率下匀浆30秒，直到将斑马鱼体内所有的细菌都释放出来。将匀浆后的大肠杆菌细菌悬浮液梯度稀释，然后涂布在添加了卡那霉素的LB固体培养基中以检测斑马鱼肠道内大肠杆菌DH5α的数量，将枯草芽孢杆菌的梯度稀释液涂布在含有氯霉素的LB固体培养基中（每个梯度至少3个平行）。将细菌培养皿置于恒温培养箱中37摄
本文编号：3446544
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无菌斑马鱼制作流程[64]
华东师范大学硕士学位论文13图2-1.pET-28a(+)质粒信息Fig2-1.TheinformationofpET-28a(+)plasmid.枯草芽孢杆菌WB800N的荧光标记选用了包含有EGFP基因和氯霉素抗性基因的pHT01质粒(BioVectorNTCCInc,Beijing,China，图2-2）。添加5ug/mL氯霉素(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)在37°C170rpm/分钟下培养菌液24h,当细菌的OD600达到0.6-0.8时，添加1μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(SigmaChemicalCo.St.Louis,MO,USA)继续培养1-2小时来诱导枯草芽孢杆菌内绿色荧光蛋白的表达。图2-2.pHT01(+)质粒信息Fig2-2.TheinformationofpHT01(+)plasmid.分别取1mL大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养液置于1.5mLEP管中1000rpm/分钟离心1分钟，待菌体沉淀于EP管底部，置于荧光显微镜下检测(SZX16,Olympus,Tokyo,Japan)。1.2.2无菌斑马鱼的制备无菌斑马鱼的制备流程在先前工作的基础上稍加改造[94]，已经在第一章第二节内详细记述。1.2.3无菌斑马鱼的单一接种将两株菌的培养液分别以7500rpm离心10分钟，将上清液从培养基中除去。继而将菌体沉淀继续在无菌水中洗涤三次，然后用无菌的GZM重悬菌体，
华东师范大学硕士学位论文14以102CFU/mL至107CFU/mL的最终浓度转移到GF斑马鱼培养基中。用无菌吸管将受精后3天（3daypostfertilization3dpf）和5dpf的GF斑马鱼幼仔分别转入6孔无菌平板(每孔10条)。无菌斑马鱼幼鱼一共分为两组：无菌斑马鱼组与单一接种组。无菌斑马鱼的单一接种是将无菌斑马鱼幼鱼暴露在浓度为102-107CFU/mL的大肠杆菌DH5α或浓度为102-106CFU/mL的枯草芽孢杆菌WB800N溶液中,并且将其置于28°C的培养箱内培养24小时或48小时。暴露于102CFU/mL到107CFU/mL大肠杆菌的斑马鱼组分别定义为2E、3E、4E、5E、6E、7E组，暴露于102CFU/mL到106CFU/mL枯草芽孢杆菌的斑马鱼组分别定义为2B、3B、4B、5B、6B组。无菌组简称为GF，正常饲养的斑马鱼简称为CONR，实验设计如图2-3。图2-3.实验设计Fig.2-3Thedesignofexperiments.1.2.4细菌定植浓度的检测斑马鱼在不同浓度的两种细菌中分别暴露24h和48h以后，为了量化每条鱼肠道内的定植菌数，将10只斑马鱼幼鱼移入1.5mL无菌试管中，用无菌水冲洗10次，去除附着于表面的细菌。随后，加入无菌玻璃珠(600mm)和500mL高压灭菌的PBS(1x)，使用震荡仪(BIO101/FP120QBioGene)在60Hz的频率下匀浆30秒，直到将斑马鱼体内所有的细菌都释放出来。将匀浆后的大肠杆菌细菌悬浮液梯度稀释，然后涂布在添加了卡那霉素的LB固体培养基中以检测斑马鱼肠道内大肠杆菌DH5α的数量，将枯草芽孢杆菌的梯度稀释液涂布在含有氯霉素的LB固体培养基中（每个梯度至少3个平行）。将细菌培养皿置于恒温培养箱中37摄
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