紫花苜蓿MsERF003基因的克隆及其在碳酸盐胁迫响应中的功能分析

发布时间：2021-10-20 23:15

　　生物治理是苏打盐碱土治理的有效方法。紫花苜蓿具有较强的抗盐碱能力,发掘其抗盐碱基因并对其潜在抗性机理进行阐释,有利于高抗碱性紫花苜蓿新品种的培育和在盐碱地生物治理中的综合利用。AP2/ERFs转录因子家族是一类与盐碱调控密切相关的转录因子,在植物的生长发育、代谢、胁迫应答、信号传导等诸多功能方面发挥着重要作用。对紫花苜蓿中这类转录因子的研究,将有助于揭示并阐释紫花苜蓿的抗盐碱机理,提供优异的抗盐碱基因,用于作物的抗盐碱育种。本研究克隆了紫花苜蓿MsERF003基因。该基因拥有长度为570bp的开放阅读框,编码190个氨基酸残基。该基因与来自蒺藜苜蓿MtERF003同源基因同源性为98.84%。通过qPCR法对其在碳酸盐胁迫下的表达模式进行了分析,发现该基因在各个器官中的表达量均有上调,在根和茎中上调尤为明显。我们构建了MtERF003启动子驱动的GUS基因表达载体,转入烟草中,获得了转基因植株。GUS染色分析表明,该基因的启动子为在烟草中是根特异性表达启动子,且只在碳酸盐胁迫下发挥作用。我们构建了过MsERF003-GFP融合表达载体,通过瞬时表达对其亚细胞定位进行了分析。结果表明Ms... 

【文章来源】：长春师范大学吉林省

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文献综述
    1.1 盐碱土及其治理
    1.2 紫花苜蓿及其抗逆性研究
    1.3 AP2/ERF转录因子的作用及研究进展
第二章 基因和启动子的克隆及分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌种与质粒
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 抗生素及培养基
    2.2 方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 紫花苜蓿MsERF003基因的克隆
            2.2.2.1 紫花苜蓿组织总RNA的提取及质量测定
            2.2.2.2 紫花苜蓿MsERF003cDNA的合成与载体连接测序
        2.2.3 MtERF003基因启动子的克隆
            2.2.3.1 蒺藜苜蓿DNA的提取及浓度测定
            2.2.3.2 启动子的PCR扩增与连接测序
        2.2.4 MsERF003-GFP融合基因的获得
            2.2.4.1 GFP基因片段的获得
            2.2.4.2 MsERF003基因与GFP基因的重叠PCR
        2.2.5 紫花苜蓿MsERF003基因生物信息学分析
        2.2.6 MtERF003基因启动子序列分析
        2.2.7 紫花苜蓿MsERF003基因的表达模式分析
    2.3 结果
        2.3.1 紫花苜蓿总RNA的提取
        2.3.2 基因及启动子的克隆
            2.3.2.1 紫花苜蓿MsERF003基因的克隆
            2.3.2.2 MtERF003基因启动子的克隆
            2.3.2.3 MsERF003-GFP基因的获得
        2.3.3 基因及启动子的测序及分析
            2.3.3.1 基因及启动子的测序及序列比对
            2.3.3.2 紫花苜蓿MsERF003基因生物信息学分析
            2.3.3.3 MtERF003基因启动子的序列分析
        2.3.4 紫花苜蓿MsERF003基因表达模式分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 载体的构建及转基因烟草的获得
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 质粒和菌种
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 抗生素及培养基
    3.2 方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 植物表达载体的构建
            3.2.2.1 pCAMBIA3301载体大片段的获取
            3.2.2.2 MsERF003目的基因片段的获取
            3.2.2.3 目的片段与载体的连接
        3.2.3 启动子表达载体的构建
            3.2.3.1 pCAMBIA3301载体大片段的获取
            3.2.3.2 启动子序列片段的获取
            3.2.3.3 启动子与载体的连接
        3.2.4 MsERF003-GFP融合表达载体的构建
            3.2.4.1 pCAMBIA3301载体大片段的获取
            3.2.4.2 MsERF003-GFP基因的获取
            3.2.4.3 MsERF003-GFP基因与载体的连接
        3.2.5 大肠杆菌菌落PCR鉴定
        3.2.6 农杆菌转化
        3.2.7 烟草遗传转化
            3.2.7.1 烟草受体材料的准备
            3.2.7.2 农杆菌的准备
            3.2.7.3 农杆菌侵染
            3.2.7.4 抑菌和恢复培养
            3.2.7.5 筛选和再生培养
            3.2.7.6 生根培养
            3.2.7.7 炼苗移栽
        3.2.8 转基因烟草的获得
            3.2.8.1 bar基因鉴定（金标试纸条鉴定）
            3.2.8.2 PCR检测
            3.2.8.3 Southern blot检测
        3.2.9 启动子活性分析
    3.3 结果
        3.3.1 植物表达载体的构建
            3.3.1.1 表达载体pCBC-MsERF003的构建
            3.3.1.2 表达载体　pCBC-MtERF003-QDZ的构建
            3.3.1.3 表达载体pCBC-MsERF003-GFP的构建
        3.3.2 农杆菌转化后的PCR检测
        3.3.3 烟草遗传转化
        3.3.4 转基因烟草的获得
            3.3.4.1 bar基因金标免疫试纸条检测
            3.3.4.2 PCR检测
            3.3.4.3 Soutern blot检测
        3.3.5 启动子活性分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 MsERF003基因在烟草抗逆中的功能分析
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 抗逆基因检测所用引物
    4.2 方法
        4.2.1 MsERF003的亚细胞定位
        4.2.2 转MsERF003基因烟草植株的碳酸盐抗性分析
            4.2.2.1 转MsERF003基因烟草的准备及qPCR分析
            4.2.2.1 脯氨酸含量测定
            4.2.2.2 丙二醛含量测定
            4.2.2.3 总糖含量测定
            4.2.2.4 抗坏血酸过氧化物酶（APX）含量测定
            4.2.2.5 过氧化氢酶（CAT）含量测定
            4.2.2.6 过氧化物酶（POD）含量测定
            4.2.2.7 K~+/Na~+含量测定
            4.2.2.8 叶绿素含量测定
    4.3 结果
        4.3.1 MsERF003的亚细胞定位
        4.3.2 转MsERF003基因烟草植株的碳酸盐抗性分析
            4.3.2.1 转MsERF003基因烟草的碳酸盐抗性表现
            4.3.2.2 碳酸盐处理下转MsERF003基因烟草的生理指标
            4.3.2.3 抗逆响应基因的表达
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
作者在攻读硕士学位期间主要研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[4]松嫩平原苏打盐碱地成因、特点及治理措施研究进展[J]. 徐子棋,许晓鸿.  中国水土保持. 2018(02)
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博士论文
[1]紫花苜蓿和燕麦抗盐碱机制研究[D]. 高战武.东北师范大学 2011

硕士论文
[1]紫花苜蓿抗盐碱能力综合评价及生理适应机制的研究[D]. 崔禄.内蒙古民族大学 2014
[2]紫花苜蓿NF-YB3基因的克隆及其耐盐功能验证[D]. 何平.吉林农业大学 2013



本文编号：3447776