造血干细胞中RNA选择性剪接的多重原位检测
发布时间：2021-10-22 14:19
基因表达的原位检测能够在细胞和组织层面上提供其空间位置信息,受到广泛的关注和应用。但同一基因通过选择性剪接可能产生多个具有不同时空特异表达的剪接体,最终不同的剪接体翻译成蛋白并行使生物学功能。因此,探索基因选择性剪接的空间表达,具有重要的生物学意义。本文旨在开发一种新型RNA多重原位检测技术,并应用于造血干细胞中的具有高度细胞特异性的基因选择性剪接的研究中。首先,我们利用人类血液肿瘤细胞系K562作为研究的基础模型,其能分化成为成熟血细胞（Erythroblasts,EBs）和巨核细胞（Megakaryocytes,MKs）,通过流式细胞术检测K562的分化效率,利用RNA原位检测技术对特异性表达的基因进行细胞层面的空间定位,并与转录组测序（RNA-seq）所得的基因表达值进行比较,证实方法对于基因表达检测的可行性。其次,基于K562,EBs和MKs的RNA-seq数据分析,我们挑选选择性剪接事件进行RNA原位检测实验,并进一步优化为RNA多重原位检测。结合测序分析的结果选择12种环状RNA（Circular RNA,circRNA）在K562、EBs这两种细胞系上进行检测。利用该方法...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同类型的选择性剪接原理示意图
第1章绪论3细胞均源自于少量的造血干细胞（Hematopoieticstemcells,HSCs）增值分化的造血祖细胞（Hematopoieticstemandprogenitorcell,HSPC）[37]。HSCs具有高度自我更新与自我分化两大特性，维持着人体的稳态与再生。如图1.2所示，根据造血干细胞的分化时期及功能作用，造血干细胞分为长效重建造血干细胞（Long-termhematopoieticstemcell,LT-HSC）和短效重建造血干细胞（Short-termhematopoieticstemcell,ST-HSC）。进而ST-HSC通过其不对称的分化，产生多能祖细胞（Multipotentprogenitorcell,MPP）[39]，MPP进一步分化为共同髓系祖细胞（Commonmyeloidprogenitorcell,CMP）和共同淋巴系祖细胞（CommonlympHoidprogenitorcell,CLP），接下来CMP进一步分化成各种髓系祖细胞。髓系多能祖细胞分化成巨核细胞/红细胞祖细胞（Megakaryocyteerythrocyteprogenitor,MEP）和粒、单核系祖细胞（Granulocytemonocyteprogenitor,GMP），这些祖细胞进一步增殖分化成为成熟血细胞和巨核细胞[40]，而与之对应的CLP分化成各种类型的淋巴细胞，如自然杀伤细胞（Naturalkillercell,NKcell）及T淋巴细胞和B淋巴细胞。图1.2骨髓中造血干细胞分化类型
华侨大学硕士学位论文6环扩增（Rollingcircleamplification,RCA）[109-110]放大技术相结合的原理，实现单分子RNA的原位检测技术。PLP在1994年由NilssonM等人[111]提出，他们将锁式探针设计为两端为与靶序列的互补配对的序列，中间为无关序列的形式，最后利用T4DNAligase连接成环。UlfLandegren的科研团队[112]在实验中，对锁式探针与靶序列进行对比，在B球蛋白基因中成功对其进行分型，从而证实了PLP的可行性。RCA是一种利用滚环复制方式的扩增技术，结合Phi29DNA聚合酶[113-116]，能够将特定的DNA、RNA分子的靶核酸信号放大[117-120]，最高可达到107放大倍数，并且由于其具有极高灵敏度等特点，目前RCA技术已广泛应用于线粒体DNA[124-125]、mRNA[126]及miRNA[121-122]等的原位检测。第四代的原位测序技术（Insitusequencing,ISS）正是基于PLP与RCA的结合原理开发应用的。2014年KeR等人[123]利用ISS首次实现了对固定细胞和乳腺癌组织中长达四个碱基的单分子RNA的测序技术（如图1.3）。该方法在保留了其空间位置信息之余，又获取到了目的基因的序列；同时，研究者指出，即使测序长度为四个碱基，仍可以利用荧光标记基团空间排列组合的原理，从而实现对单分子RNA的44=256种的多重原位检测。图1.3RNA原位测序原理图（引自KeR等）
本文编号：3451276
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同类型的选择性剪接原理示意图
第1章绪论3细胞均源自于少量的造血干细胞（Hematopoieticstemcells,HSCs）增值分化的造血祖细胞（Hematopoieticstemandprogenitorcell,HSPC）[37]。HSCs具有高度自我更新与自我分化两大特性，维持着人体的稳态与再生。如图1.2所示，根据造血干细胞的分化时期及功能作用，造血干细胞分为长效重建造血干细胞（Long-termhematopoieticstemcell,LT-HSC）和短效重建造血干细胞（Short-termhematopoieticstemcell,ST-HSC）。进而ST-HSC通过其不对称的分化，产生多能祖细胞（Multipotentprogenitorcell,MPP）[39]，MPP进一步分化为共同髓系祖细胞（Commonmyeloidprogenitorcell,CMP）和共同淋巴系祖细胞（CommonlympHoidprogenitorcell,CLP），接下来CMP进一步分化成各种髓系祖细胞。髓系多能祖细胞分化成巨核细胞/红细胞祖细胞（Megakaryocyteerythrocyteprogenitor,MEP）和粒、单核系祖细胞（Granulocytemonocyteprogenitor,GMP），这些祖细胞进一步增殖分化成为成熟血细胞和巨核细胞[40]，而与之对应的CLP分化成各种类型的淋巴细胞，如自然杀伤细胞（Naturalkillercell,NKcell）及T淋巴细胞和B淋巴细胞。图1.2骨髓中造血干细胞分化类型
华侨大学硕士学位论文6环扩增（Rollingcircleamplification,RCA）[109-110]放大技术相结合的原理，实现单分子RNA的原位检测技术。PLP在1994年由NilssonM等人[111]提出，他们将锁式探针设计为两端为与靶序列的互补配对的序列，中间为无关序列的形式，最后利用T4DNAligase连接成环。UlfLandegren的科研团队[112]在实验中，对锁式探针与靶序列进行对比，在B球蛋白基因中成功对其进行分型，从而证实了PLP的可行性。RCA是一种利用滚环复制方式的扩增技术，结合Phi29DNA聚合酶[113-116]，能够将特定的DNA、RNA分子的靶核酸信号放大[117-120]，最高可达到107放大倍数，并且由于其具有极高灵敏度等特点，目前RCA技术已广泛应用于线粒体DNA[124-125]、mRNA[126]及miRNA[121-122]等的原位检测。第四代的原位测序技术（Insitusequencing,ISS）正是基于PLP与RCA的结合原理开发应用的。2014年KeR等人[123]利用ISS首次实现了对固定细胞和乳腺癌组织中长达四个碱基的单分子RNA的测序技术（如图1.3）。该方法在保留了其空间位置信息之余，又获取到了目的基因的序列；同时，研究者指出，即使测序长度为四个碱基，仍可以利用荧光标记基团空间排列组合的原理，从而实现对单分子RNA的44=256种的多重原位检测。图1.3RNA原位测序原理图（引自KeR等）
本文编号：3451276
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