利用CRISPR/Cas9系统批量化敲除家蚕重要性状相关基因
发布时间：2021-11-03 18:32
家蚕（Bombyx mori L.）,属完全变态的鳞翅目昆虫,是目前最重要的经济昆虫之一。养蚕缫丝的发明是中国人民对世界文明作出的卓越贡献。近年来,中国蚕丝产业形势愈加严峻,家蚕品种改良可促进我国蚕丝产业的发展,很好的缓解这种严峻形势。从驯化的角度来说,家蚕在人工选择下众多经济性状及性能相较于其野生祖先野桑蚕发生了显著的提升。揭示家蚕和野桑蚕之间生物学差异的遗传基础,不仅能够探究家蚕的驯化机制,还能够发现家蚕吐丝能力增强的一些线索。基因组测序和大数据的兴起以及基因编辑技术,尤其是CRISPR/Cas9技术的快速发展使得我们能够更容易的进行基因编辑,研究家蚕中某些基因的生物学功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在家蚕多化地方品系nistari中敲除丝蛋白基因（丝素重链基因和P25基因）和6个人工选择信号较强的驯化基因（BGIBMGA011266-TA（储存蛋白）、BGIBMGA014418-TA（锌指蛋白）、BGIBMGA000221-TA（隐花色素 1）、BGIBMGA007789-TA（隐花色素 2）。BGIBMGA012700-TA（谷氨酸合成酶）、BGIBMGA01...
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 家蚕文献综述
1.1 丝绸行业现状
1.2 蚕桑业现状
1.3 家蚕生物反应器研究进展和面临的瓶颈
1.4 对家蚕驯化基因研究的必要性和有利条件
1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展
1.6 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除的备选基因
第二章 敲除丝素重链探究丝胶茧形成机制
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 CRISPR/Cas9敲除的方法及突变体的获得
2.2.2 突变体转录组分析
2.3 结果分析
2.3.1 丝素重链基因阅读框移码突变突变体获得
2.3.2 转录组分析
2.4 讨论
第三章 利用CRISPR/Cas9敲除家蚕存储蛋白1基因揭示其在蚕卵孵化中的重要作用
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 构建部分鳞翅目昆虫储存蛋白进化树
3.2.3 sgRNA设计及合成
3.2.4 sgRNA体外转录
3.2.5 Cas9质粒线性化
2.2.6 Cas9 mRNA体外转录
2.2.7 显微注射实验前准备
2.2.8 注射卵的制备
3.2.9 显微注射预实验
3.2.10 显微注射
3.2.11 突变体筛选
3.2.12 纯合突变体编码蛋白预测
3.2.13 RNA提取
3.2.14 cDNA转录
3.2.15 qPCR分析
3.2.16 纯合突变体表型观察及统计
3.3 结果
3.3.1 确定BmSp1属于蛋氨酸富集储存蛋白
3.3.2 sgRNA位点设计和BmSp1突变类型
3.3.3 筛选纯合突变体和突变体编码蛋白预测
3.3.4 BmSp1基因在突变体脂肪体中表达情况
3.3.5 突变引起孵化率显著降低,但是不影响茧重和蛹重
3.4 讨论
第四章 P25以及驯化相关基因在多化地方品系nistari中的敲除以及后续分析
4.1 基因信息
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 sgRNA设计及合成
4.2.3 sgRNA体外转录
4.2.4 Cas9质粒线性化
4.2.5 Cas9 mRNA体外转录
4.2.6 显微注射实验前准备
4.2.7 注射卵的制备
4.2.8 显微注射预实验
4.2.9 显微注射
4.2.10 突变体筛选
4.3 结果
4.3.1 敲除P25基因导致吐丝量减少,但是不影响正常吐丝
4.3.2 敲除锌指蛋白幼虫死亡率增加,蛹期呈现多态性
4.3.3 在驯化过程受到人工选择的氨基酸代谢通路相关基因敲除
4.3.4 节律基因的敲除
4.4 讨论
第五章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在云南本地实用品系中的可行性探索
5.1 基因信息
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 sgRNA设计及合成
5.2.3 sgRNA体外转录
5.2.4 Cas9质粒线性化
5.2.5 Cas9 mRNA体外转录
5.2.6 显微注射实验前准备
5.2.7 注射卵的制备
5.2.8 显微注射预实验
5.2.9 显微注射
5.2.10 突变体检测
5.3 结果
5.3.1 P25基因敲除后代滞育后目前没有孵化
5.3.2 BGIBMGA000612-TA, BGIBMGA000648-TA, BGIBMGA006831-TA6,BGIBMGA000601-TA突变检测
5.4 讨论
第六章 总结和展望
致谢
参考文献
附录A 攻读学位期间发表及待发表论文
附录B 攻读学位期间申请专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑技术最新研究进展[J]. 刘玉彪,许馨,曹山虎,孙绍光. 生物技术通报. 2017(06)
[2]家蚕等昆虫贮存蛋白的研究进展[J]. 侯成香,覃光星,郭锡杰. 中国蚕业. 2016(04)
[3]广西茧丝绸业发展经验和做法[J]. 梁维佳,吴青. 广西蚕业. 2016(02)
[4]CRISPR-Cas9驱动的基因编辑新纪元[J]. 熊彬彬,曾虎,刘云坤,孙宇辉. 微生物学通报. 2017(01)
[5]东桑西移与北桑南移——蚕桑产业转移动因分析[J]. 熊超,胡兴明. 中国蚕业. 2015(01)
[6]山西省茧丝绸行业分析报告[J]. 畅晋钢. 中国蚕业. 2014(03)
[7]家蚕生物反应器的研究概述[J]. 崔振腾,陈亚洁,曾鹏,金卫明,费建明,李玉峰,时连根. 蚕桑通报. 2013(03)
[8]温度与光照节律对家蚕成虫生物钟基因Cry1和Cry2表达的影响[J]. 张达燕,梁辉,司马杨虎,徐世清. 蚕业科学. 2013(03)
[9]重振蚕桑丝绸之雄风[J]. 胡祚忠,肖金树,叶晶晶,吴建梅,张剑飞. 丝绸. 2011(11)
[10]piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展[J]. 钟伯雄,危浩,庄兰芳. 中国农业科学. 2011(21)
博士论文
[1]基于基因组编辑的家蚕丝腺遗传改良与应用研究[D]. 马三垣.西南大学 2014
本文编号：3474138
【文章来源】：昆明理工大学云南省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 家蚕文献综述
1.1 丝绸行业现状
1.2 蚕桑业现状
1.3 家蚕生物反应器研究进展和面临的瓶颈
1.4 对家蚕驯化基因研究的必要性和有利条件
1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展
1.6 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除的备选基因
第二章 敲除丝素重链探究丝胶茧形成机制
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 CRISPR/Cas9敲除的方法及突变体的获得
2.2.2 突变体转录组分析
2.3 结果分析
2.3.1 丝素重链基因阅读框移码突变突变体获得
2.3.2 转录组分析
2.4 讨论
第三章 利用CRISPR/Cas9敲除家蚕存储蛋白1基因揭示其在蚕卵孵化中的重要作用
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 构建部分鳞翅目昆虫储存蛋白进化树
3.2.3 sgRNA设计及合成
3.2.4 sgRNA体外转录
3.2.5 Cas9质粒线性化
2.2.6 Cas9 mRNA体外转录
2.2.7 显微注射实验前准备
2.2.8 注射卵的制备
3.2.9 显微注射预实验
3.2.10 显微注射
3.2.11 突变体筛选
3.2.12 纯合突变体编码蛋白预测
3.2.13 RNA提取
3.2.14 cDNA转录
3.2.15 qPCR分析
3.2.16 纯合突变体表型观察及统计
3.3 结果
3.3.1 确定BmSp1属于蛋氨酸富集储存蛋白
3.3.2 sgRNA位点设计和BmSp1突变类型
3.3.3 筛选纯合突变体和突变体编码蛋白预测
3.3.4 BmSp1基因在突变体脂肪体中表达情况
3.3.5 突变引起孵化率显著降低,但是不影响茧重和蛹重
3.4 讨论
第四章 P25以及驯化相关基因在多化地方品系nistari中的敲除以及后续分析
4.1 基因信息
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 sgRNA设计及合成
4.2.3 sgRNA体外转录
4.2.4 Cas9质粒线性化
4.2.5 Cas9 mRNA体外转录
4.2.6 显微注射实验前准备
4.2.7 注射卵的制备
4.2.8 显微注射预实验
4.2.9 显微注射
4.2.10 突变体筛选
4.3 结果
4.3.1 敲除P25基因导致吐丝量减少,但是不影响正常吐丝
4.3.2 敲除锌指蛋白幼虫死亡率增加,蛹期呈现多态性
4.3.3 在驯化过程受到人工选择的氨基酸代谢通路相关基因敲除
4.3.4 节律基因的敲除
4.4 讨论
第五章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在云南本地实用品系中的可行性探索
5.1 基因信息
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 sgRNA设计及合成
5.2.3 sgRNA体外转录
5.2.4 Cas9质粒线性化
5.2.5 Cas9 mRNA体外转录
5.2.6 显微注射实验前准备
5.2.7 注射卵的制备
5.2.8 显微注射预实验
5.2.9 显微注射
5.2.10 突变体检测
5.3 结果
5.3.1 P25基因敲除后代滞育后目前没有孵化
5.3.2 BGIBMGA000612-TA, BGIBMGA000648-TA, BGIBMGA006831-TA6,BGIBMGA000601-TA突变检测
5.4 讨论
第六章 总结和展望
致谢
参考文献
附录A 攻读学位期间发表及待发表论文
附录B 攻读学位期间申请专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑技术最新研究进展[J]. 刘玉彪,许馨,曹山虎,孙绍光. 生物技术通报. 2017(06)
[2]家蚕等昆虫贮存蛋白的研究进展[J]. 侯成香,覃光星,郭锡杰. 中国蚕业. 2016(04)
[3]广西茧丝绸业发展经验和做法[J]. 梁维佳,吴青. 广西蚕业. 2016(02)
[4]CRISPR-Cas9驱动的基因编辑新纪元[J]. 熊彬彬,曾虎,刘云坤,孙宇辉. 微生物学通报. 2017(01)
[5]东桑西移与北桑南移——蚕桑产业转移动因分析[J]. 熊超,胡兴明. 中国蚕业. 2015(01)
[6]山西省茧丝绸行业分析报告[J]. 畅晋钢. 中国蚕业. 2014(03)
[7]家蚕生物反应器的研究概述[J]. 崔振腾,陈亚洁,曾鹏,金卫明,费建明,李玉峰,时连根. 蚕桑通报. 2013(03)
[8]温度与光照节律对家蚕成虫生物钟基因Cry1和Cry2表达的影响[J]. 张达燕,梁辉,司马杨虎,徐世清. 蚕业科学. 2013(03)
[9]重振蚕桑丝绸之雄风[J]. 胡祚忠,肖金树,叶晶晶,吴建梅,张剑飞. 丝绸. 2011(11)
[10]piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展[J]. 钟伯雄,危浩,庄兰芳. 中国农业科学. 2011(21)
博士论文
[1]基于基因组编辑的家蚕丝腺遗传改良与应用研究[D]. 马三垣.西南大学 2014
本文编号：3474138
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