山东省及周边地区2013-2018年猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传进化分析
发布时间：2021-11-07 05:42
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病病毒（PRRSV）引起的一种病毒性传染病,它能引起母猪流产、早产、死胎、畸形胎及仔猪、育肥猪呼吸道等症状。自1995年PRRS传入中国至今已有25年,2001年后该病开始频繁发生。尤其近几年由于我国PRRSV频繁发生变异,导致PRRSV毒株复杂多样,这使得PRRS的防控工作增加了巨大的难度。本研究为了解山东及周边地区PRRSV的流行及变异情况,对本实验室自2013年保存的2000份疑似阳性病料,利用RT-PCR方法进行检测并对确定为阳性样品进行病毒分离与鉴定,结果分离到20株PRRSV。将分离的20株PRRSV进行RNA提取并反转录成cDNA,利用12对PRRSV全长引物进行全基因组DNA序列扩增、测序和序列拼接,将拼接完成的基因序列同国内外GenBank中代表性的PRRSV参考毒株比对,从而进行基因序列同源性、系统遗传进化树、部分NSP2和ORF5基因推导的氨基酸关键位点及重组毒株分析。分析结果显示,本研究分离20株PRRSV在基因系统进化树上形成了三个大分支,即谱系8/亚系8.1（CH-1a-like）、谱系8/亚系8.7（JX...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRRSV粒子示意图（田克恭，2015）
’端为非翻译区(UTR)和ploy（A）尾序列，欧洲型和美洲型之间序列同源性仅为76%(刘光清等，2002)。中间包括相互重叠的10个开放阅读框（ORF），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6、ORF7(Conzelmannetal.,1993;Meulenbergetal.,1993)，每个开放阅读框编码特异性病毒蛋白，参与病毒的复制。其中ORF1约占全长的80%，长度约10~12kb,ORF1a、ORF1b分别编码非结构蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2~NSP9和NSP8~NSP12。ORF2a~ORF7分别编码结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M、N。PRRSV基因组结构如图2图2PRRSV基因组结构示意图(BrarMS.etal.，2015)Fig.2StructuralDiagramofPRRSVgenome(BrarMS,etal.，2015)1.2.3PRRSV非结构蛋白及功能ORF1a和ORF1b为非结构蛋白开放阅读框，编码复制酶和聚合蛋白，约占全基因组的三分之二,共编码13个非结构蛋白(SnijderEJetal.,2001)，分别为NSP1α、NSP1β、NSP2~12，参与PRRSV的复制，非结构蛋白基因也是整个病毒基因组中变异最大的基因（Forsbergetal.,2001；Songetal.,2012）。NSP1α和NSP1β是一种复制酶非结构蛋白，两者都具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性的区域，它们是从ppla和pplab多聚蛋白上切割下来的（Ziebuhretal.,2000）。NSP1α由180个氨基酸组成，大小19kDa，以二聚体的形式存在,而NSP1β含有203个氨基酸，大小为23kDa的多肽（Plagemann,2004）。相关研究表明NSP1α在病毒转录过程中起着重要作用，它能抑制干扰素的产生，使病毒对细胞的感染性增强。非结构蛋白NSP2是ORF1a中最大的蛋白，也是不同毒株之间基因型差别最大的区域，NSP2在自
山东省及周边地区2013-2018年猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传进化分析20图3-1分离毒株N基因检测结果Fig3-1IsolatePRRSVNgenetestresults注：M:DL2000DNAMarker1:ANSZ-p9-20132：SDLY-p6-20133：SDYT-p13-20134：SDLY-p11-20135：SDLY-p14-20136：ANSZ-p10-20137：SDWF-p8-3-20148：SDLC-23-2015:9：SDRZ-10-12-201510：SDTA-CM-201511：SDGM-7-3-201612：SDDP-31-201613：ANSZ-32-201614：HBHD-201715：SDJY-201716：SDTA-MZ-201717：SDJN-LH-201718：SDHZ-201719：SDTA-MM-201820：SDLC-CP-201821：阴性对照3.1.2病毒分离结果PRRSV阳性样品接种Marc-145细胞,于36h、48h观察细胞病变，36h时开始出现轻微病变，48h时细胞开始出现圆缩聚集成团，折光性增强现象，继续培养至60~72h，观察到细胞开始脱落、裂解甚至死亡现象；对照组细胞始终未出现病变，不同毒株出现病变的程度不同。分离PRRSV在Marc-145细胞的60hCPE，结果说明分离到了能使Marc-145细胞发生病变的PRRSV。如图3-2。图3-2分离毒株对Marc-145细胞引起的病变结果Fig3-2CPEcausedbystrainsPRRSVonMarc-145cells注：A为阳性对照TA-12（100x）B为本研究分离代表毒株SDJY-2017（100x）C为阴性对照（100x）3.1.3病毒的鉴定通过间接免疫荧光（IFA）的方法，将分离的PRRSV接种在Marc-145细胞上进行IFA鉴定，结果显示Marc-145细胞中有PRRSV的增殖，证明成功分离到PRRSV。如M192021
【参考文献】：
期刊论文
[1]2014年～2019年PRRSV主要流行毒株在我国的变化[J]. 张洪亮,张文立,许浒,宋帅杰,赵静,相丽润,冷超粮,李真,刘春晓,汤艳东,陈家锃,彭金美,王倩,安同庆,童光志,蔡雪辉,田志军. 中国预防兽医学报. 2020(05)
[2]山东及周边部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异与遗传演化分析[J]. 胡栋,徐煜琳,朱迎春,赵情,王亭亭,庞恒,李传刚,于江,常维山,吴家强,彭军. 畜牧兽医学报. 2019(06)
[3]猪呼吸与繁殖综合征病毒综述[J]. 田原,王建,洪春晖,王娇,陈丹清,金森,王华琴,顾志刚. 上海畜牧兽医通讯. 2019(01)
[4]猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化[J]. 杨汉春,周磊. 生命科学. 2016(03)
[5]猪繁殖与呼吸综合征病毒结构和非结构蛋白生物学功能研究进展[J]. 张松林,沈志强,刘磊,马永彪,刘吉山. 畜牧兽医学报. 2012(11)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 刘鹤,刘永刚,石文达,王淑杰,武嘉男,董建国,荣福龙,李丽琴,徐明明,孙刚,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2011(10)
[7]我国华东某省HP-PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 朱紫祥,吴发兴,王晶钰,李平,高许雷,张燕霞,张志,刘爽,李晓成. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(08)
[8]PRRSV经典与高致病性毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立[J]. 肖跃强,管宇,唐娜,魏凤,杨慧,曲光刚,沈志强. 中国兽医学报. 2010(07)
[9]高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株Nsp2基因分段克隆表达及其单克隆抗体的制备[J]. 胡鸿惠,曹振,赵铁柱,王斌,秦亚嫚,杨璐,王传彬,陈西钊,田克恭. 中国畜牧兽医. 2009(10)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展[J]. 高志强,郭鑫,杨汉春. 中国农业科技导报. 2002(06)
硕士论文
[1]2012-2013年河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及河南流行株的分离、鉴定[D]. 周峰.河南农业大学 2014
本文编号：3481274
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRRSV粒子示意图（田克恭，2015）
’端为非翻译区(UTR)和ploy（A）尾序列，欧洲型和美洲型之间序列同源性仅为76%(刘光清等，2002)。中间包括相互重叠的10个开放阅读框（ORF），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6、ORF7(Conzelmannetal.,1993;Meulenbergetal.,1993)，每个开放阅读框编码特异性病毒蛋白，参与病毒的复制。其中ORF1约占全长的80%，长度约10~12kb,ORF1a、ORF1b分别编码非结构蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2~NSP9和NSP8~NSP12。ORF2a~ORF7分别编码结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M、N。PRRSV基因组结构如图2图2PRRSV基因组结构示意图(BrarMS.etal.，2015)Fig.2StructuralDiagramofPRRSVgenome(BrarMS,etal.，2015)1.2.3PRRSV非结构蛋白及功能ORF1a和ORF1b为非结构蛋白开放阅读框，编码复制酶和聚合蛋白，约占全基因组的三分之二,共编码13个非结构蛋白(SnijderEJetal.,2001)，分别为NSP1α、NSP1β、NSP2~12，参与PRRSV的复制，非结构蛋白基因也是整个病毒基因组中变异最大的基因（Forsbergetal.,2001；Songetal.,2012）。NSP1α和NSP1β是一种复制酶非结构蛋白，两者都具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性的区域，它们是从ppla和pplab多聚蛋白上切割下来的（Ziebuhretal.,2000）。NSP1α由180个氨基酸组成，大小19kDa，以二聚体的形式存在,而NSP1β含有203个氨基酸，大小为23kDa的多肽（Plagemann,2004）。相关研究表明NSP1α在病毒转录过程中起着重要作用，它能抑制干扰素的产生，使病毒对细胞的感染性增强。非结构蛋白NSP2是ORF1a中最大的蛋白，也是不同毒株之间基因型差别最大的区域，NSP2在自
山东省及周边地区2013-2018年猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传进化分析20图3-1分离毒株N基因检测结果Fig3-1IsolatePRRSVNgenetestresults注：M:DL2000DNAMarker1:ANSZ-p9-20132：SDLY-p6-20133：SDYT-p13-20134：SDLY-p11-20135：SDLY-p14-20136：ANSZ-p10-20137：SDWF-p8-3-20148：SDLC-23-2015:9：SDRZ-10-12-201510：SDTA-CM-201511：SDGM-7-3-201612：SDDP-31-201613：ANSZ-32-201614：HBHD-201715：SDJY-201716：SDTA-MZ-201717：SDJN-LH-201718：SDHZ-201719：SDTA-MM-201820：SDLC-CP-201821：阴性对照3.1.2病毒分离结果PRRSV阳性样品接种Marc-145细胞,于36h、48h观察细胞病变，36h时开始出现轻微病变，48h时细胞开始出现圆缩聚集成团，折光性增强现象，继续培养至60~72h，观察到细胞开始脱落、裂解甚至死亡现象；对照组细胞始终未出现病变，不同毒株出现病变的程度不同。分离PRRSV在Marc-145细胞的60hCPE，结果说明分离到了能使Marc-145细胞发生病变的PRRSV。如图3-2。图3-2分离毒株对Marc-145细胞引起的病变结果Fig3-2CPEcausedbystrainsPRRSVonMarc-145cells注：A为阳性对照TA-12（100x）B为本研究分离代表毒株SDJY-2017（100x）C为阴性对照（100x）3.1.3病毒的鉴定通过间接免疫荧光（IFA）的方法，将分离的PRRSV接种在Marc-145细胞上进行IFA鉴定，结果显示Marc-145细胞中有PRRSV的增殖，证明成功分离到PRRSV。如M192021
【参考文献】：
期刊论文
[1]2014年～2019年PRRSV主要流行毒株在我国的变化[J]. 张洪亮,张文立,许浒,宋帅杰,赵静,相丽润,冷超粮,李真,刘春晓,汤艳东,陈家锃,彭金美,王倩,安同庆,童光志,蔡雪辉,田志军. 中国预防兽医学报. 2020(05)
[2]山东及周边部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异与遗传演化分析[J]. 胡栋,徐煜琳,朱迎春,赵情,王亭亭,庞恒,李传刚,于江,常维山,吴家强,彭军. 畜牧兽医学报. 2019(06)
[3]猪呼吸与繁殖综合征病毒综述[J]. 田原,王建,洪春晖,王娇,陈丹清,金森,王华琴,顾志刚. 上海畜牧兽医通讯. 2019(01)
[4]猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化[J]. 杨汉春,周磊. 生命科学. 2016(03)
[5]猪繁殖与呼吸综合征病毒结构和非结构蛋白生物学功能研究进展[J]. 张松林,沈志强,刘磊,马永彪,刘吉山. 畜牧兽医学报. 2012(11)
[6]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备[J]. 刘鹤,刘永刚,石文达,王淑杰,武嘉男,董建国,荣福龙,李丽琴,徐明明,孙刚,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2011(10)
[7]我国华东某省HP-PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 朱紫祥,吴发兴,王晶钰,李平,高许雷,张燕霞,张志,刘爽,李晓成. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(08)
[8]PRRSV经典与高致病性毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立[J]. 肖跃强,管宇,唐娜,魏凤,杨慧,曲光刚,沈志强. 中国兽医学报. 2010(07)
[9]高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株Nsp2基因分段克隆表达及其单克隆抗体的制备[J]. 胡鸿惠,曹振,赵铁柱,王斌,秦亚嫚,杨璐,王传彬,陈西钊,田克恭. 中国畜牧兽医. 2009(10)
[10]猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展[J]. 高志强,郭鑫,杨汉春. 中国农业科技导报. 2002(06)
硕士论文
[1]2012-2013年河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及河南流行株的分离、鉴定[D]. 周峰.河南农业大学 2014
本文编号：3481274
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