基于CRISPR/Cas9系统的B16F10细胞CD44基因定向修饰的功能研究
发布时间：2021-11-13 08:27
CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶（ZFNs）技术和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术后新的基因编辑技术。与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9系统具有操作简单,花费低的优点。CRISPR/Cas系统有三种类型,即I型、II型和III型,其中II型是最为简单的,人们将其改为基因组定点修饰技术,即CRISPR/Cas9系统。CD44是一组分布极为广泛的多分子形式的膜整合糖蛋白,可以在细胞中介导粘附作用,参与细胞之间特异性粘连过程,包括细胞与细胞之间,细胞与基质之间等。大量研究表明,CD44分子在许多恶性肿瘤中表达,参与肿瘤的发生及其调控,但当前CD44分子的作用机制尚不明确,所以,建立CD44表达降低的小鼠黑色素瘤（B16F10）细胞研究其CD44蛋白的作用有重要的意义。研究目的:利用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术,在小鼠黑色素瘤细胞中建立CD44表达降低的细胞株,并以CD44表达降低的细胞为研究对象,进行各种生物学活性的检测。研究方法:（1）对CD44基因设计sgRNA序列,sg RNA序列与线性化的PX459质粒连接形成重组质粒,经测序验证,构...
【文章来源】：鲁东大学山东省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
嗜热链球菌CRISPR/Cas系统基本结构
图 2 CRISPR/Cas 系统干扰外源噬菌体入侵示意图[35]Fig 2 CRISPR/Cas system interference with exogenous phage intrusions1.1.4 sgRNA 的设计与选择根据前边介绍及研究，我们得知 sgRNA 的设计和选择是 CRISPR/Cas9 技术的精髓，也是实验成功与否的关键。因为 sgRNA 决定了 Cas9 的靶向性和特异性，
目前广泛应用的土壤农杆菌系统来说：sgRNA 结合的靶基因序列的 3’端必G 序列（N 可以为 A、T、C、G 任意碱基），即 PAM 序列（例如本实验所–GAATACACCTGCGTAGCGGCAGG-3’），Cas9 会在 PAM 序列 5’端大约对 DNA 序列进行切割（见图 3）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]神经皮肤黑色素细胞增生伴原发颅内黑色素瘤[J]. 赵程程,姚坤. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版). 2013(06)
[2]TALENs:Customizable Molecular DNA Scissors for Genome Engineering of Plants[J]. Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[3]CD44与乳腺癌的研究进展[J]. 赵书,黄彬. 四川解剖学杂志. 2011(02)
[4]CD44在胃癌中研究新进展[J]. 涂琦,刘勇,戴艳枝. 江西医药. 2010(12)
[5]CD44分子变异体在胃癌转移中的研究进展[J]. 侯振江,郑玉中,单保恩. 中国肿瘤临床与康复. 2008(05)
[6]Isolation and biological analysis of tumor stem cells from pancreatic adenocarcinoma[J]. Peng Huang, Chun-You Wang, Shan-Miao Gou, He-Shui Wu, Tao Liu, Jiang-Xin Xiong, Department of Pancreatic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2008(24)
[7]CD44v6在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 仲宁,沈振亚,郑世营,余云生,叶文学,焦鹏,黄浩岳. 苏州大学学报(医学版). 2008(02)
[8]CD44v3在非小细胞肺癌中的表达以及对生存率的预测价值[J]. 吴秋平,蒋耀光,闵家新,罗世忠. 中国肺癌杂志. 2003(06)
本文编号：3492690
【文章来源】：鲁东大学山东省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
嗜热链球菌CRISPR/Cas系统基本结构
图 2 CRISPR/Cas 系统干扰外源噬菌体入侵示意图[35]Fig 2 CRISPR/Cas system interference with exogenous phage intrusions1.1.4 sgRNA 的设计与选择根据前边介绍及研究，我们得知 sgRNA 的设计和选择是 CRISPR/Cas9 技术的精髓，也是实验成功与否的关键。因为 sgRNA 决定了 Cas9 的靶向性和特异性，
目前广泛应用的土壤农杆菌系统来说：sgRNA 结合的靶基因序列的 3’端必G 序列（N 可以为 A、T、C、G 任意碱基），即 PAM 序列（例如本实验所–GAATACACCTGCGTAGCGGCAGG-3’），Cas9 会在 PAM 序列 5’端大约对 DNA 序列进行切割（见图 3）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]神经皮肤黑色素细胞增生伴原发颅内黑色素瘤[J]. 赵程程,姚坤. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版). 2013(06)
[2]TALENs:Customizable Molecular DNA Scissors for Genome Engineering of Plants[J]. Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[3]CD44与乳腺癌的研究进展[J]. 赵书,黄彬. 四川解剖学杂志. 2011(02)
[4]CD44在胃癌中研究新进展[J]. 涂琦,刘勇,戴艳枝. 江西医药. 2010(12)
[5]CD44分子变异体在胃癌转移中的研究进展[J]. 侯振江,郑玉中,单保恩. 中国肿瘤临床与康复. 2008(05)
[6]Isolation and biological analysis of tumor stem cells from pancreatic adenocarcinoma[J]. Peng Huang, Chun-You Wang, Shan-Miao Gou, He-Shui Wu, Tao Liu, Jiang-Xin Xiong, Department of Pancreatic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2008(24)
[7]CD44v6在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 仲宁,沈振亚,郑世营,余云生,叶文学,焦鹏,黄浩岳. 苏州大学学报(医学版). 2008(02)
[8]CD44v3在非小细胞肺癌中的表达以及对生存率的预测价值[J]. 吴秋平,蒋耀光,闵家新,罗世忠. 中国肺癌杂志. 2003(06)
本文编号：3492690
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