利用CRISPR/Cas9技术研究OTUD5基因在三阴性乳腺癌细胞增殖过程中的作用
发布时间：2021-11-16 17:01
研究背景及研究目的:随着生命科学的发展,医学的进步,我国人民生活水平显著提高,威胁人类健康的传染性疾病得到了有效控制。然而随着寿命的延长和生存环境的影响等,肿瘤已成为威胁我国人民健康和生命的重要因素。基因组的不稳定性造成了肿瘤细胞的高度变异性,使其难于防治。据估算我国每年用于肿瘤诊治的花费高达千亿元,给社会和家庭带来沉重负担。发现新的药物靶点,对肿瘤的治疗具有重要意义。泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质特异性降解的主要途径,参与细胞内多种过程,如基因转录、细胞周期调节、免疫反应、肿瘤的发生以及炎症的过程等。去泛素化酶使得泛素化修饰成为可逆的过程,确保了细胞中生命活动的动态平衡。近年来,随着人们对泛素-蛋白酶体系统在肿瘤发生、发展中扮演角色的深入研究,泛素-蛋白酶体系统已成为一种新的肿瘤治疗靶点。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年兴起的第三代人工核酸内切酶系统。该系统由规律成簇间隔回文重复序列以及其相关蛋白9所组成,与之前的第一代锌指核酸酶（ZFN）和第二代类转录因子激活效应物人工核酸酶（TALEN）相比具有构建方法简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等优势,已经成为科学研究...
【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9基因编辑技术作用机制Figure1TheprincipleofCRISPR/Cas9geneeditingtechnology
中国人民解放军军事医学科学院受到外界刺激导致 DNA 发生损 蛋白，导致 PDCD5 蛋白在细胞中P53 蛋白形成四聚体，作用于 DN路，导致细胞发生凋亡[22, 23]。研性进程相关，也就是说当 OTUD凋亡（图 2）。然而在我的研究 OTUD5 基因之后，细胞在未经试图对这一实验现象进一步研究
图 3 A.荧光显微镜下观察 Cas9-GFP 腺病毒感染 MDA-MB-231 细胞（10×20）；B. T7E1实验和 Western Blot 结果；C. MTS 检测细胞生长结果；D.细胞的克隆形成实验结果。Figure 3 A. Microscopic observation of Cas9-GFP adenovirus infected MDA-MB-231 cells(10 ×20); B. Results of T7E1 experiment and Western Blot; C. Cell growth curve; D. Cell colonyformation experiment.3.3 构建一体化 LentiCRISPR v2-OTUD5-gRNA，在 MDA-MB-231 细胞中检测的 OTUD5 基因敲低后细胞状况通过多个 gRNA 的共同检测，避免了细胞生长受到抑制这一现象是由于OTUD5-gRNA0 的脱靶效应来造成的。在 OTUD5 基因的不同区域又分别设计了4 条 sgRNA，连同 E3 库中的 gRNA0共 5 条 sgRNA，利用更为简便的 LentiCRISPR的系统对 OTUD5 基因进行敲除（图 4A），并同样使用经典细胞增殖检测实验进行鉴定，发现 OTUD5 蛋白能够对细胞增殖产生影响，蛋白水平敲低越彻底细胞增殖抑制越明显（图 4B，4C）。这就说明 OTUD5 蛋白可以调控细胞增殖这一现
【参考文献】：
期刊论文
[1]慢病毒介导的调节因子XⅠ过表达及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用[J]. 程凯,孙浩杰,张明智,沈丽. 中南大学学报(医学版). 2016(11)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
硕士论文
[1]腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统和BioID在研究体内蛋白相互作用中的应用[D]. 赵泉丞.安徽医科大学 2015
本文编号：3499229
【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9基因编辑技术作用机制Figure1TheprincipleofCRISPR/Cas9geneeditingtechnology
中国人民解放军军事医学科学院受到外界刺激导致 DNA 发生损 蛋白，导致 PDCD5 蛋白在细胞中P53 蛋白形成四聚体，作用于 DN路，导致细胞发生凋亡[22, 23]。研性进程相关，也就是说当 OTUD凋亡（图 2）。然而在我的研究 OTUD5 基因之后，细胞在未经试图对这一实验现象进一步研究
图 3 A.荧光显微镜下观察 Cas9-GFP 腺病毒感染 MDA-MB-231 细胞（10×20）；B. T7E1实验和 Western Blot 结果；C. MTS 检测细胞生长结果；D.细胞的克隆形成实验结果。Figure 3 A. Microscopic observation of Cas9-GFP adenovirus infected MDA-MB-231 cells(10 ×20); B. Results of T7E1 experiment and Western Blot; C. Cell growth curve; D. Cell colonyformation experiment.3.3 构建一体化 LentiCRISPR v2-OTUD5-gRNA，在 MDA-MB-231 细胞中检测的 OTUD5 基因敲低后细胞状况通过多个 gRNA 的共同检测，避免了细胞生长受到抑制这一现象是由于OTUD5-gRNA0 的脱靶效应来造成的。在 OTUD5 基因的不同区域又分别设计了4 条 sgRNA，连同 E3 库中的 gRNA0共 5 条 sgRNA，利用更为简便的 LentiCRISPR的系统对 OTUD5 基因进行敲除（图 4A），并同样使用经典细胞增殖检测实验进行鉴定，发现 OTUD5 蛋白能够对细胞增殖产生影响，蛋白水平敲低越彻底细胞增殖抑制越明显（图 4B，4C）。这就说明 OTUD5 蛋白可以调控细胞增殖这一现
【参考文献】：
期刊论文
[1]慢病毒介导的调节因子XⅠ过表达及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用[J]. 程凯,孙浩杰,张明智,沈丽. 中南大学学报(医学版). 2016(11)
[2]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波. 遗传. 2011(03)
硕士论文
[1]腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统和BioID在研究体内蛋白相互作用中的应用[D]. 赵泉丞.安徽医科大学 2015
本文编号：3499229
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