在斑马鱼中运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除及对斑马鱼第二波永久造血作用之初探
发布时间：2021-12-29 23:01
第一部分斑马鱼（Danio rerio）为原产喜马拉雅山脉东南区域（包括印度、巴基斯坦、柬埔寨等国家和地区）的一种观赏用热带淡水鱼,其作为一种脊椎模式生物被应用于科学研究肇始于1970年代。经过30余年从无到有、由浅及深的认识过程,这种体积小、繁殖快、易于饲养的硬骨鱼类正以其巨大的优势愈来愈被人们所重视。随着斑马鱼基因组测序的全面完成,人们发现至少70%的人类基因在斑马鱼中都存在至少一个同源基因,这使得斑马鱼成为了功能基因组时代最重要的模式生物之一。要研究基因的功能,一个重要的、甚至是首选的做法就是,敲除或者突变该基因,进而研究该基因功能缺失条件下的表现型。定点敲除基因的技术在近几年发展迅速,ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等基因敲除系统不断涌现,相比于前两者操作繁琐、突变效率低的缺点,CRISPR/Cas9技术以其简便高效的特点成为最近最为流行的基因组定点编辑技术。本研究即是使用CRISPR/Cas9系统针对数个斑马鱼基因做定点敲除并探究其工作条件、工作效率及基因敲除突变体的表现型。首先,作者使用已报道的方法合成人密码子优化的Cas9mRNA和基因特异的gRNA,用不同...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 遗传研究的方法和基因敲除
1.1.1 遗传研究方法总述
1.1.2 现代基因敲除技术的先军——ZFNs
1.1.3 现代基因敲除技术的典范——TALENs
1.1.4 现代基因敲除技术的新宠——RISPR/Cas9
1.2 斑马鱼简介及其研究现状
1.2.1 斑马鱼简介
1.2.2 斑马鱼的研究现状
1.3 斑马鱼的造血作用
1.3.1 斑马鱼的造血作用之总述
1.3.2 由实时成像技术发现斑马鱼中HSC的产生过程
第二章 绪论
2.1 本研究工作的目的和意义
2.1.1 利用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中进行基因敲除
2.1.2 利用转基因系Tg(corola：Kaede)追踪造血干细胞的分化及迁移
2.1.3 制作血液系统相关转基因斑马鱼品系以期结合转基因系进一步探讨HSPCs的分化去路
2.2 本研究工作的研究内容和预期结果
2.2.1 本研究工作的研究内容
2.2.2 本研究工作的预期结果
第三章 实验材料与方法
3.1 斑马鱼品系、饲养及其生活史
3.1.1 斑马鱼简介及品系
3.1.2 斑马鱼的饲养
3.2 实验仪器、试剂以及耗材
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验耗材
3.3 试剂配制
3.3.1 分子克隆相关
3.3.2 分子生物学实验相关
3.3.3 其他试剂
3.4 菌株和质粒
3.5 利用MgCl_2法制备E. coli DH5α感受态细胞
3.6 利用CRISPR/Cas9技术制作斑马鱼突变体
3.6.1 针对基因设计CRISPR/Cas9系统工作目标位点
3.6.2 利用pXT7-hCas9制作hCas9 mRNA
3.6.3 利用pMD19T-gRNA和PCR制作基因特异的gRNA
3.6.4 显微注射
3.6.5 通过测序检测系统瞬时工作效率
3.6.6 通过T-A末端连接进一步检测工作效率
3.6.7 通过测序从F0代中筛选可遗传突变的个体
3.6.8 通过测序从F1代中筛选稳定遗传的突变个体
3.6.9 通过杂合子自交探究某基因突变体的表型
3.7 使用Tg(corola：Kaede)短时追踪HSPCs的分裂与分化
3.8 使用tol2系统制作转基因斑马鱼
3.8.1 转座酶mRNA的制备
3.8.2 显微注射
3.8.3 对转基因家系F0代的验证
3.8.4 对转基因家系F1代的验证
第四章 研究结果与分析
4.1 利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的尝试及规律总结
4.1.1 hCas9 mRNA和gRNA注射剂量的尝试
4.1.2 针对1号染色体上4个基因的敲除实验
4.1.3 对成功和失败的靶点设计案例进行分别的规律总结
4.1.4 应用规律在3个感兴趣基因(GOD中设计靶点的敲除效果
4.2 使用转基因系Tg(corola：Kaede)追踪HSPCs的结果
4.2.1 corola-Kaede可标记HSPCs
4.2.2 Kaede蛋白可在高能激光辐照下改变构象
4.2.3 使用光可变荧光蛋白Kaede对CHT产生的HSPCs进行跟踪成像结果
4.2.4 对更多AGM/CHT产生HSPCs的追踪结果
4.3 制作转基因斑马鱼品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)
第五章 结论与建议
5.1 CRISPR/Cas9工作效率可变性的探讨
5.2 CHT发生的HSPCs和AGM区相比的联系和差异
5.3 转基因品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)的制作
参考文献
附录
致谢
在读期间发表论文及参与课题
发表论文
参与其他课题
【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient Gene Targeting in Zebrafish Mediated by a Zebrafish-Codon-Optimized Cas9 and Evaluation of Off-Targeting Effect[J]. Da Liu,Zhanxiang Wang,An Xiao,Yutian Zhang,Wenyuan Li,Yao Zu,Shaohua Yao,Shuo Lin,Bo Zhang. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
[2]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[3]斑马鱼研究走向生物医学[J]. 李辉辉,黄萍,董巍,朱作言,刘东. 遗传. 2013(04)
[4]A Systematic Phenotypic Screen of F-box Genes Through a Tissue-specific RNAi-based Approach in Drosophila[J]. Wen Dui~(a,b,c),Wei Lu~a,Jun Ma~(c,d,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Division of Biomedical Informatics,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA d Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA. 遗传学报. 2012(08)
[5]Drosophila sbo regulates lifespan through its function in the synthesis of coenzyme Q in vivo[J]. Jiyong Liu~(a,b),Qinghua Wu~(a,b),Dianlu He~a,Tengyu Ma~a,Li Du~a,Wen Dui~(a,b), Xiaoyan Guo~(a,c),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China b Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Department of Biology,Texas A&M University,College Station,TX 77843,USA. 遗传学报. 2011(06)
本文编号：3557004
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 遗传研究的方法和基因敲除
1.1.1 遗传研究方法总述
1.1.2 现代基因敲除技术的先军——ZFNs
1.1.3 现代基因敲除技术的典范——TALENs
1.1.4 现代基因敲除技术的新宠——RISPR/Cas9
1.2 斑马鱼简介及其研究现状
1.2.1 斑马鱼简介
1.2.2 斑马鱼的研究现状
1.3 斑马鱼的造血作用
1.3.1 斑马鱼的造血作用之总述
1.3.2 由实时成像技术发现斑马鱼中HSC的产生过程
第二章 绪论
2.1 本研究工作的目的和意义
2.1.1 利用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中进行基因敲除
2.1.2 利用转基因系Tg(corola：Kaede)追踪造血干细胞的分化及迁移
2.1.3 制作血液系统相关转基因斑马鱼品系以期结合转基因系进一步探讨HSPCs的分化去路
2.2 本研究工作的研究内容和预期结果
2.2.1 本研究工作的研究内容
2.2.2 本研究工作的预期结果
第三章 实验材料与方法
3.1 斑马鱼品系、饲养及其生活史
3.1.1 斑马鱼简介及品系
3.1.2 斑马鱼的饲养
3.2 实验仪器、试剂以及耗材
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验耗材
3.3 试剂配制
3.3.1 分子克隆相关
3.3.2 分子生物学实验相关
3.3.3 其他试剂
3.4 菌株和质粒
3.5 利用MgCl_2法制备E. coli DH5α感受态细胞
3.6 利用CRISPR/Cas9技术制作斑马鱼突变体
3.6.1 针对基因设计CRISPR/Cas9系统工作目标位点
3.6.2 利用pXT7-hCas9制作hCas9 mRNA
3.6.3 利用pMD19T-gRNA和PCR制作基因特异的gRNA
3.6.4 显微注射
3.6.5 通过测序检测系统瞬时工作效率
3.6.6 通过T-A末端连接进一步检测工作效率
3.6.7 通过测序从F0代中筛选可遗传突变的个体
3.6.8 通过测序从F1代中筛选稳定遗传的突变个体
3.6.9 通过杂合子自交探究某基因突变体的表型
3.7 使用Tg(corola：Kaede)短时追踪HSPCs的分裂与分化
3.8 使用tol2系统制作转基因斑马鱼
3.8.1 转座酶mRNA的制备
3.8.2 显微注射
3.8.3 对转基因家系F0代的验证
3.8.4 对转基因家系F1代的验证
第四章 研究结果与分析
4.1 利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的尝试及规律总结
4.1.1 hCas9 mRNA和gRNA注射剂量的尝试
4.1.2 针对1号染色体上4个基因的敲除实验
4.1.3 对成功和失败的靶点设计案例进行分别的规律总结
4.1.4 应用规律在3个感兴趣基因(GOD中设计靶点的敲除效果
4.2 使用转基因系Tg(corola：Kaede)追踪HSPCs的结果
4.2.1 corola-Kaede可标记HSPCs
4.2.2 Kaede蛋白可在高能激光辐照下改变构象
4.2.3 使用光可变荧光蛋白Kaede对CHT产生的HSPCs进行跟踪成像结果
4.2.4 对更多AGM/CHT产生HSPCs的追踪结果
4.3 制作转基因斑马鱼品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)
第五章 结论与建议
5.1 CRISPR/Cas9工作效率可变性的探讨
5.2 CHT发生的HSPCs和AGM区相比的联系和差异
5.3 转基因品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)的制作
参考文献
附录
致谢
在读期间发表论文及参与课题
发表论文
参与其他课题
【参考文献】：
期刊论文
[1]Efficient Gene Targeting in Zebrafish Mediated by a Zebrafish-Codon-Optimized Cas9 and Evaluation of Off-Targeting Effect[J]. Da Liu,Zhanxiang Wang,An Xiao,Yutian Zhang,Wenyuan Li,Yao Zu,Shaohua Yao,Shuo Lin,Bo Zhang. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
[2]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[3]斑马鱼研究走向生物医学[J]. 李辉辉,黄萍,董巍,朱作言,刘东. 遗传. 2013(04)
[4]A Systematic Phenotypic Screen of F-box Genes Through a Tissue-specific RNAi-based Approach in Drosophila[J]. Wen Dui~(a,b,c),Wei Lu~a,Jun Ma~(c,d,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Division of Biomedical Informatics,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA d Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA. 遗传学报. 2012(08)
[5]Drosophila sbo regulates lifespan through its function in the synthesis of coenzyme Q in vivo[J]. Jiyong Liu~(a,b),Qinghua Wu~(a,b),Dianlu He~a,Tengyu Ma~a,Li Du~a,Wen Dui~(a,b), Xiaoyan Guo~(a,c),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China b Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Department of Biology,Texas A&M University,College Station,TX 77843,USA. 遗传学报. 2011(06)
本文编号：3557004
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