新型单分子RNA多重原位检测技术的开发和应用
发布时间：2022-01-06 08:41
多重原位杂交技术能够对RNA的表达丰度和空间位置进行检测,这为基因研究提供了新的思路。本文旨在开发一种基于锁式探针的新型单分子RNA多重原位检测技术,拟解决目前多重原位检测方法操作步骤繁琐、基于逆转录的单分子RNA多重原位检测效率低下以及可用光谱分辨的荧光染料的数量有限等问题。首先,我们对新型单分子RNA多重原位检测在乳腺癌细胞中的不同mRNA原位检测进行了探索。对应用于多重原位检测的新型锁式探针的设计进行了尝试,与以往探针不同的是我们通过在锁式探针上的三个位置插入条形码DNA片段,每个序列对应一个独特的荧光标记检测探针,通过在三轮检测之后,理论上可以对于64种基因进行多重检测;其次,我们在SK-BR-3、MDA-MB-231和T-47D这3种乳腺癌细胞系上对相关基因如HER2、ESR1、PGR及MKI67等完成了多达39种基因的多重检测,其结果显示,ESR1和PGR这两个基因在T-47D上的信号检出量最高,而HER2和MKI67这两个基因则分别在SK-BR-3和MDA-MB-231上有最高的信号检出量,结果和人类蛋白质图谱计划中的结果一致。此外,我们将SK-BR-3和T-47D中待测...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
原位测序原理图（引自KeR等）
第1章绪论7组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，还通过error-robust编码方案，来抵消单分子标记和检测错误。研究人员用MERFISH技术对数百个细胞进行了分析，可在单细胞中同时成像100-1000种RNA。他们还通过相关分析绘制了基因调控网络，预测了基因功能，鉴定了与蛋白属性有关的RNA分布模式[39]。但是，MERFISH产生的单个RNA分子的信号的亮度在应用时可能会受到限制，例如增加成像通量，成像较短的RNA和对背景度较高的组织样品进行成像[40]。ChenglongXia等人开发了一种MERFISH和分支DNA（branchDNA,bDNA）结合的方法[40]。为了实现这个方案（图1.2），首先将编码探针结合到MERFISH样本上，然后再结合一组初级扩增子寡核苷酸探针，其中每组初级扩增子寡核苷酸探针包括一个与读出序列互补的初级扩增子以及一个20-mer重复的简并核苷酸探针；然后将一组次级扩增子寡核苷酸添加到样品中。每组次级扩增子都靶向一个相应的初级扩增子上的结合位点，并包含另一个独特的20-mer的重复简并核苷酸；最后将次级放大器上结合位点的荧光标记探针与样品杂交。以这种方式，每个原始的读出序列将被扩增成另一个结合序列的N2个拷贝，从而允许结合N2个荧光探针。最终可以在不增加光斑尺寸的情况下将光斑亮度增加一个数量级以上，并且它们不会增加光斑亮度的可变性。bDNA扩增与MERFISH的结合将促进许多其他应用，并扩大该技术在细胞培养和组织中解决生物学问题的范围。图1.3MERFISH成像的bDNA扩增示意图（引自ChenglongXia等）（a）MERFISH编码探针片段（b）初级扩增子结合示意图（c）次级扩增子介示意图
不同基因进行不同颜色的检测探针直接检测，实现同时对几十个基因进行原位检测。StenLinnarsson等人提出的环形单分子荧光原位杂交技术（cyclic-ouroborossmFISHmethod,osmFISH）则采取了在每一轮反应中只检测有限的几个基因，图像采集完毕后，用甲酰胺去除探针进行下一轮杂交，最后经过多轮的杂交定义了体感皮层的细胞组织（图1.4）。osmFISH检测的目标基因数目由荧光通道数和杂交数轮数决定。并且由于不使用条码序列，因此可以分别对每个图像进行全面分析，并且高表达基因（光斑重叠难以分辨）不会影响低表达基因的检测。图1.4osmFISH原理示意图（引自StenLinnarsson等）1.3本课题选题背景及预期1.3.1本课题选题背景精准医学的出现使得对单个肿瘤进行分子鉴定成为可能，从而能够为每位患者量身定制治疗方案。然而，肿瘤异质性使精准治疗难以进行，因为在同一肿瘤中可能存在具有不同治疗敏感性和/或表型特征的多个亚克隆[48]，因此使得医生在选择特定治疗方法时变得更加困难。此外，肿瘤异质性的研究也需要空间分辨技术的技术，这种技术能够深入研究肿瘤组织内不同细胞生态环境及其信号通路，以此来揭示有关其调控生物学的信息。当前乳腺癌诊断依靠组织病理学的综合评估，包括肿瘤分级和ER，PR，HER2（与ISH/FISH结合）以及KI67的免疫组织化学染色。或对均质化组织的大细胞裂解物进行互补分子分析，例如下一代测序，Mammaprint[49]，OncotypeDX复发评分[50]和PAM50[51]。乳腺癌在肿瘤内和肿瘤间均表现出异质性，具有数千种不同的突变和在每个肿瘤中独特的数个拷贝数变异，以及具有不同基因组改变的亚克隆变异。在乳腺癌中经常观察到肿瘤内ER[52]和KI67[53]表达的异质性，在HER2阳性乳腺癌中也观察
本文编号：3572135
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：110 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
原位测序原理图（引自KeR等）
第1章绪论7组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，还通过error-robust编码方案，来抵消单分子标记和检测错误。研究人员用MERFISH技术对数百个细胞进行了分析，可在单细胞中同时成像100-1000种RNA。他们还通过相关分析绘制了基因调控网络，预测了基因功能，鉴定了与蛋白属性有关的RNA分布模式[39]。但是，MERFISH产生的单个RNA分子的信号的亮度在应用时可能会受到限制，例如增加成像通量，成像较短的RNA和对背景度较高的组织样品进行成像[40]。ChenglongXia等人开发了一种MERFISH和分支DNA（branchDNA,bDNA）结合的方法[40]。为了实现这个方案（图1.2），首先将编码探针结合到MERFISH样本上，然后再结合一组初级扩增子寡核苷酸探针，其中每组初级扩增子寡核苷酸探针包括一个与读出序列互补的初级扩增子以及一个20-mer重复的简并核苷酸探针；然后将一组次级扩增子寡核苷酸添加到样品中。每组次级扩增子都靶向一个相应的初级扩增子上的结合位点，并包含另一个独特的20-mer的重复简并核苷酸；最后将次级放大器上结合位点的荧光标记探针与样品杂交。以这种方式，每个原始的读出序列将被扩增成另一个结合序列的N2个拷贝，从而允许结合N2个荧光探针。最终可以在不增加光斑尺寸的情况下将光斑亮度增加一个数量级以上，并且它们不会增加光斑亮度的可变性。bDNA扩增与MERFISH的结合将促进许多其他应用，并扩大该技术在细胞培养和组织中解决生物学问题的范围。图1.3MERFISH成像的bDNA扩增示意图（引自ChenglongXia等）（a）MERFISH编码探针片段（b）初级扩增子结合示意图（c）次级扩增子介示意图
不同基因进行不同颜色的检测探针直接检测，实现同时对几十个基因进行原位检测。StenLinnarsson等人提出的环形单分子荧光原位杂交技术（cyclic-ouroborossmFISHmethod,osmFISH）则采取了在每一轮反应中只检测有限的几个基因，图像采集完毕后，用甲酰胺去除探针进行下一轮杂交，最后经过多轮的杂交定义了体感皮层的细胞组织（图1.4）。osmFISH检测的目标基因数目由荧光通道数和杂交数轮数决定。并且由于不使用条码序列，因此可以分别对每个图像进行全面分析，并且高表达基因（光斑重叠难以分辨）不会影响低表达基因的检测。图1.4osmFISH原理示意图（引自StenLinnarsson等）1.3本课题选题背景及预期1.3.1本课题选题背景精准医学的出现使得对单个肿瘤进行分子鉴定成为可能，从而能够为每位患者量身定制治疗方案。然而，肿瘤异质性使精准治疗难以进行，因为在同一肿瘤中可能存在具有不同治疗敏感性和/或表型特征的多个亚克隆[48]，因此使得医生在选择特定治疗方法时变得更加困难。此外，肿瘤异质性的研究也需要空间分辨技术的技术，这种技术能够深入研究肿瘤组织内不同细胞生态环境及其信号通路，以此来揭示有关其调控生物学的信息。当前乳腺癌诊断依靠组织病理学的综合评估，包括肿瘤分级和ER，PR，HER2（与ISH/FISH结合）以及KI67的免疫组织化学染色。或对均质化组织的大细胞裂解物进行互补分子分析，例如下一代测序，Mammaprint[49]，OncotypeDX复发评分[50]和PAM50[51]。乳腺癌在肿瘤内和肿瘤间均表现出异质性，具有数千种不同的突变和在每个肿瘤中独特的数个拷贝数变异，以及具有不同基因组改变的亚克隆变异。在乳腺癌中经常观察到肿瘤内ER[52]和KI67[53]表达的异质性，在HER2阳性乳腺癌中也观察
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