1、WAP抗菌肽的表达与功能研究 2、家蝇proPO系统关键基因的鉴定与表达分析

发布时间：2022-01-16 04:20

　　无脊椎动物没有获得性免疫,只有先天性免疫,而先天性免疫包括细胞免疫和体液免疫,抗菌肽和proPO激活系统则是体液免疫的两种重要组成成分,在昆虫的免疫系统中发挥重要作用。本文主要研究了wap抗菌肽和proPO激活系统,对抗菌肽在真核生物体内的功能以及体外表达进行了研究,对proPO激活系统中的关键基因进行了定位与分类,并对其表达模式进行了初步的探索。本文利用果蝇这一遗传背景清晰的真核生物,将外源wap基因导入果蝇体内,构建了VAS-wap转基因果蝇品系。并利用遗传变异法对wap在UAS-wap转基因果蝇品系中的染色体位置进行了基因定位,得到了wap分别插入在转基因果蝇性染色体、第二染色体、第三染色体基因型的品系,将它们与actin-Ga14果蝇杂交,实现了wap基因在它们杂交后代果蝇中的过表达,通过QPCR检测发现,wap基因在mRNA水平的表达量明显高于对照,有的达100多倍。并对wap抗菌肽在转基因果蝇体内的抗菌功能进行了探究与验证,并获得了明确的抗菌效果。该结果为新型抗菌药物的研发奠定了良好的基础。随着大家对抗菌肽的重视程度越来越高,已经有人用原核表达系统在体外成功的获得了WAP重... 

【文章来源】：济南大学山东省

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
导师简介
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 WAP抗菌肽简介
    1.2 WAP抗菌肽的研究意义
第二章 wap在转基因果蝇的染色体定位和表达水平分析
    2.1 实验材料与仪器设备
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 果蝇饲养
        2.2.2 遗传杂交法定位wap基因在转基因果蝇染色体的插入位点
        2.2.4 wap在转基因果蝇体内的表达水平分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 wap在转基因果蝇染色体定位的结果
        2.3.2 qRT-PCR分析wap在转基因果蝇体内RNA水平表达结果
    2.4 结论
第三章 WAP抗菌肽在果蝇体内的抗菌功能
    3.1 实验材料与仪器试剂
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验仪器与试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌液的制备
        3.2.2 实验组果蝇与对照组果蝇的制备
        3.2.3 果蝇存活与死亡情况的观察比较
    3.3 结果与分析
    3.4 结论
第四章 WAP抗菌肽在真核表达系统的表达
    4.1 实验材料与仪器试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验溶液配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 wap/pPIC9K表达载体的构建
            4.2.1.1 WAP抗菌肽基因的钓取与扩增
            4.2.1.2 wap/pPIC9K表达载体的构建
        4.2.2 酵母的转化
            4.2.2.1 KM71毕赤酵母菌感受态细胞的制备
            4.2.2.2 转化
        4.2.3 WAP的诱导表达
            4.2.3.1 阳性转化子的筛选
            4.2.3.2 诱导表迭
    4.3 结果与分析
        4.3.1 wap/pPICPK重组载体构建
        4.3.2 SDS-PAGE电泳检测结果
    4.4 结论
第五章 WAP抗菌肽在原核表达系统的表达与功能分析
    5.1 实验材料与试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 WAP抗菌肽基因的钓取与扩增
        5.2.2 WAP重组载体的构建与筛选
            5.2.2.1 酶切
            5.2.2.2 连接
            5.2.2.3 转化
            5.2.2.4 筛选阳性转化子,提取重组质粒
            5.2.2.5 重组质粒的验证
        5.2.3 WAP体外表达菌株的构建与筛选
        5.2.4 试表达筛选最优表达条件
            5.2.4.1 诱导表达时间的摸索
            5.2.4.2 诱导剂浓度的摸索
            5.2.4.3 诱导表达温度的摸索
        5.2.5 WAP重组蛋白的分离纯化
        5.2.7 WAP抗菌肽重组蛋白的活性与功能检测
            5.2.7.1 WAP抗菌肽体外抑蛋白酶活性检测
            5.2.7.2 WAP抗菌肽体外抑菌活性检测
    5.3 结果与分析
        5.3.1 WAP抗菌肽基因的PCR钓取与扩增结果
        5.3.2 WAP重组载体的构建与筛选结果
        5.3.3 WAP体外表达菌株的构建与筛选结果
        5.3.4 体外诱导最优条件的确定
        5.3.5 WAP重组蛋白纯化回收的结果
        5.3.6 WAP重组蛋白抑蛋白酶活性的测定结果
    5.4 结论
附：第一章 家蝇proPO系统简介
附：第二章 家蝇proPO系统关键基因的鉴定与表达分析
    2.1 实验材料与仪器设备
        2.1.1 家蝇与菌种
        2.1.2 试剂与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 家蝇proPO系统关键基因的鉴定
            2.2.1.1 家蝇转录组测序
            2.2.1.2 转录组序列筛选
            2.2.1.3 序列拼接
            2.2.1.4 序列分析
            2.2.1.5 基因鉴定与分类
            2.2.1.6 测序验证
        2.2.2 家蝇proPO系统关键基因的表达模式分析
            2.2.2.1 提取家蝇幼虫的RNA
            2.2.2.2 反转录cDNA
            2.2.2.3 qRT-PCR
        2.2.3 家蝇mdPAP1的克隆与蛋白重组表达
            2.2.3.1 mdPAP1基因ORF框的克隆
            2.2.3.2 mdPAP1重组载体的构建
            2.2.3.3 mdPAPP1表达菌株的构建与筛选
        2.2.4 家蝇酚氧化酶原激活酶的体内RNAi实验
    2.3 结果与分析
        2.3.1 家蝇Serpin基因的鉴定与分类结果
        2.3.2 家蝇proPO系统关键基因的表达模式分析
        2.3.3 家蝇mdPAP1的克隆与蛋白重组表达
        2.3.4 家蝇mdPAP1的体内RNAi实验
    2.4 结论
结论与展望
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3591924