ICP34.5蛋白增强重组Ⅱ型单纯疱疹病毒复制的研究
发布时间：2022-01-22 21:38
目的:通过建立稳转细胞系,探究Ⅰ型（HSV1）和Ⅱ型（HSV2）基因产物对重组Ⅱ型单纯疱疹病毒（o HSV2）复制的影响。方法:合成HSV1-ICP34.5和HSV2-ICP34.5基因序列,连接至Piggy Bac-Dual-promoter（PBDP）真核表达载体上,并通过测序进行确认。将重组真核表达载体转染到Vero细胞和BHK细胞,构建表达ICP34.5基因的稳转细胞系。用荧光显微镜及流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP,为稳转成功指示蛋白）的表达,用PCR扩增、实时荧光定量PCR及免疫印染来鉴定ICP34.5目的基因及表达。再用稳转细胞系来生产o HSV2病毒,通过CCID50方法检测病毒滴度来评估ICP34.5蛋白对o HSV2复制的影响。结果:共获得4种稳转细胞系,分别为VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5和BHKHSV2-ICP34.5;4种新稳转细胞系于荧光显微镜下均能观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达,流式检测阳性细胞比例达到百分之九十以上;4种新稳转细胞系经免疫印染检测均能表达ICP34.5蛋白,用PCR...
【文章来源】：湖北科技学院湖北省
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒酶切产物
湖北科技学院硕士学位论文173.实验结果3.1重组质粒酶切鉴定及质粒浓度测定图1：重组质粒酶切产物图2：重组质粒浓度测定将新构建的重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5进行酶切鉴定，结果如图1。从图1可知，第二、第三、第四泳道都是重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5样品，三个泳道均出现目的条带；第七、第八、第九泳道都是重组质粒PBDP-HSV2-ICP34.5样品，三个泳道均出现目的条带。结果表明目的片段均成功插入真核表达载体PBDP。由其他生物公司帮助测序的结果表明，两个构建的新重组质粒测序结果与HSV1-ICP34.5、HSV2-ICP34.5序列一致，表明成功构建重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5。将构建的重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5各取15μl，分别与3μlLoadingBuffer混匀，再按5μl、4μl、3μl、2μl、1μl的浓度梯度加入到凝胶孔中，MarKer加5μl和10μl，电泳结束后，如图2所示。由图2可知，第二至第六泳道都为PBDP-HSV1-ICP34.5样品，并且条带亮度依次降低；第八至第十二泳道都为PBDP-HSV2-ICP34.5样品，并且条带亮度依次降低。根据与MarKer条带对比，可以计算出PBDP-HSV1-ICP34.5重组质粒浓度为80ng/μl，PBDP-HSV2-ICP34.5重组质粒浓度为50ng/μl。
湖北科技学院硕士学位论文193.3PCR鉴定稳定表达ICP34.5的Vero细胞系和BHK细胞系图7：PCR鉴定表达ICP34.5的Vero细胞系图8：PCR鉴定表达ICP34.5的BHK细胞系将6种细胞（Vero、VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5、BHK和BHKHSV2-ICP34.5）从液氮罐中复苏，分别传代至T75细胞培养瓶中，待细胞汇合度达80%-90%时，用DNAzol试剂提取六种细胞的DNA，用PCR法鉴定细胞DNA中是否含有ICP34.5基因，结果如图7，图8所示。从图7可知，VeroHSV1-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为765bp，空白对照无条带；VeroHSV2-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为804bp，空白对照无条，故VeroHSV1-ICP34.5细胞和VeroHSV2-ICP34.5细胞中均含有目的基因。从图8可知，BHKHSV1-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为765bp，空白对照无条带；BHKHSV2-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为804bp，空白对照无条带，故BHKHSV1-ICP34.5细胞和BHKHSV2-ICP34.5细胞中均含有目的基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]溶瘤病毒抗肿瘤的研究进展[J]. 陈莹,刘滨磊. 中国新药杂志. 2019(21)
[2]溶瘤病毒T-Vec应用于肿瘤治疗的临床研究进展[J]. 姚星妹,潘莉莉,吴婷. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2019(04)
[3]溶瘤病毒作为治疗肿瘤新疗法的探讨[J]. 冯超,徐晨昶,刘睿,沈辉. 现代免疫学. 2018(06)
[4]溶瘤免疫治疗的机遇与挑战[J]. 魏继武. 医学研究生学报. 2018(07)
[5]Carrier Cells for Delivery of Oncolytic Measles Virus into Tumors:Determinants of Efficient Loading[J]. Chun Xu,Mao Xia,Gang Meng,Chunyan Li,Aiqin Jiang,Jiwu Wei. Virologica Sinica. 2018(03)
[6]肿瘤治疗的新突破:溶瘤病毒治疗[J]. 喻启桂. 安徽医药. 2018(01)
[7]新药研究与开发[J]. 黄世杰. 国际药学研究杂志. 2017(09)
[8]NK细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J]. 任海龙,邵东燕,李琦,师俊玲,杨慧,靳明亮,黄庆生. 现代免疫学. 2017(03)
[9]PD-1及PD-L1与肿瘤适应性免疫抵抗的研究进展[J]. 王一唯,吴霞. 现代免疫学. 2016(06)
[10]人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型（OH2）生物学特性的稳定性[J]. 李延飞,毛泽勇,石晓太,邹建文,董玉婷,孙美玲,刘滨磊,方志正. 中国生物制品学杂志. 2016(05)
本文编号：3602942
【文章来源】：湖北科技学院湖北省
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒酶切产物
湖北科技学院硕士学位论文173.实验结果3.1重组质粒酶切鉴定及质粒浓度测定图1：重组质粒酶切产物图2：重组质粒浓度测定将新构建的重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5进行酶切鉴定，结果如图1。从图1可知，第二、第三、第四泳道都是重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5样品，三个泳道均出现目的条带；第七、第八、第九泳道都是重组质粒PBDP-HSV2-ICP34.5样品，三个泳道均出现目的条带。结果表明目的片段均成功插入真核表达载体PBDP。由其他生物公司帮助测序的结果表明，两个构建的新重组质粒测序结果与HSV1-ICP34.5、HSV2-ICP34.5序列一致，表明成功构建重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5。将构建的重组质粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5各取15μl，分别与3μlLoadingBuffer混匀，再按5μl、4μl、3μl、2μl、1μl的浓度梯度加入到凝胶孔中，MarKer加5μl和10μl，电泳结束后，如图2所示。由图2可知，第二至第六泳道都为PBDP-HSV1-ICP34.5样品，并且条带亮度依次降低；第八至第十二泳道都为PBDP-HSV2-ICP34.5样品，并且条带亮度依次降低。根据与MarKer条带对比，可以计算出PBDP-HSV1-ICP34.5重组质粒浓度为80ng/μl，PBDP-HSV2-ICP34.5重组质粒浓度为50ng/μl。
湖北科技学院硕士学位论文193.3PCR鉴定稳定表达ICP34.5的Vero细胞系和BHK细胞系图7：PCR鉴定表达ICP34.5的Vero细胞系图8：PCR鉴定表达ICP34.5的BHK细胞系将6种细胞（Vero、VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5、BHK和BHKHSV2-ICP34.5）从液氮罐中复苏，分别传代至T75细胞培养瓶中，待细胞汇合度达80%-90%时，用DNAzol试剂提取六种细胞的DNA，用PCR法鉴定细胞DNA中是否含有ICP34.5基因，结果如图7，图8所示。从图7可知，VeroHSV1-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为765bp，空白对照无条带；VeroHSV2-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为804bp，空白对照无条，故VeroHSV1-ICP34.5细胞和VeroHSV2-ICP34.5细胞中均含有目的基因。从图8可知，BHKHSV1-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为765bp，空白对照无条带；BHKHSV2-ICP34.5和阳性对照均出现目的条带，大小为804bp，空白对照无条带，故BHKHSV1-ICP34.5细胞和BHKHSV2-ICP34.5细胞中均含有目的基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]溶瘤病毒抗肿瘤的研究进展[J]. 陈莹,刘滨磊. 中国新药杂志. 2019(21)
[2]溶瘤病毒T-Vec应用于肿瘤治疗的临床研究进展[J]. 姚星妹,潘莉莉,吴婷. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2019(04)
[3]溶瘤病毒作为治疗肿瘤新疗法的探讨[J]. 冯超,徐晨昶,刘睿,沈辉. 现代免疫学. 2018(06)
[4]溶瘤免疫治疗的机遇与挑战[J]. 魏继武. 医学研究生学报. 2018(07)
[5]Carrier Cells for Delivery of Oncolytic Measles Virus into Tumors:Determinants of Efficient Loading[J]. Chun Xu,Mao Xia,Gang Meng,Chunyan Li,Aiqin Jiang,Jiwu Wei. Virologica Sinica. 2018(03)
[6]肿瘤治疗的新突破:溶瘤病毒治疗[J]. 喻启桂. 安徽医药. 2018(01)
[7]新药研究与开发[J]. 黄世杰. 国际药学研究杂志. 2017(09)
[8]NK细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J]. 任海龙,邵东燕,李琦,师俊玲,杨慧,靳明亮,黄庆生. 现代免疫学. 2017(03)
[9]PD-1及PD-L1与肿瘤适应性免疫抵抗的研究进展[J]. 王一唯,吴霞. 现代免疫学. 2016(06)
[10]人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型（OH2）生物学特性的稳定性[J]. 李延飞,毛泽勇,石晓太,邹建文,董玉婷,孙美玲,刘滨磊,方志正. 中国生物制品学杂志. 2016(05)
本文编号：3602942
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