两处高盐环境中慢生单胞菌检测、细菌群落结构分析及两株新菌的多相分类
发布时间：2022-07-02 16:01
慢生单胞菌为分离自海洋沉积物中的捕食性细菌类群,其分离工作的难度较高,因此对于该类群检测方法的研究,对确定其在环境中的分布情况以及与其他类群相关关系分析有着重要意义。本研究针对慢生单胞菌目设计出了特异性的寡核苷酸探针,并通过纯培养菌株实验对其严谨性及覆盖度进行了验证。根据探针序列设计并合成一对荧光定量PCR引物。实验验证发现所设计出的寡核苷酸探针可以与目前已培养的所有慢生单胞菌物种进行杂交,同时与本实验所选择的非目标类群杂交结果为阴性。进而选取了文登盐场5个不同盐度梯度的盐池以及运城盐湖6个盐池的沉积物样品作为研究对象,使用16S rRNA基因序列扩增子测序、qPCR以及荧光原位杂交三种方法对样品中的慢生单胞菌目丰度进行分析。通过16S rRNA基因扩增子测序检测,在所有盐湖及盐场的沉积物样品中都检测到了慢生单胞菌目的存在,共注释出属于慢生单胞菌目的91个OTU,其中文登盐场沉积物中独有的OTU有49个,运城盐湖沉积物中独有的OTU有15个,慢生单胞菌目在文登盐场平均相对丰度为0.81%,在运城盐湖所有沉积物样品中的平均相对丰度为0.16%。通过qPCR对样品中细菌16S rDNA序列...
【文章页数】：152 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 绪论
1.1 高盐环境及其中的微生物
1.1.1 高盐环境及其分类
1.1.2 高盐环境中的微生物
1.1.3 国内外对高盐环境微生物的研究
1.2 环境中的微生物群落及其网络分析
1.3 慢生单胞菌目及其研究进展
1.4 环境微生物的检测方法
1.4.1 培养方法检测环境中的微生物
1.4.2 荧光原位杂交技术
1.4.3 高通量测序技术
1.4.4 定量PCR (Quantitative-PCR)
1.5 立题依据
第二章 慢生单胞菌目水平探针及引物的设计
2.1 实验材料
2.1.1 实验样品与菌株
2.1.2 主要仪器与设备
2.1.3 实验试剂与耗材
2.1.4 溶液与培养基配置
2.2 实验方法
2.2.1 慢生单胞菌目特异性探针的设计及合成
2.2.2 以探针序列为引物进行高通量测序验证探针的可靠性
2.2.3 实验所用菌株的培养以及菌体收集
2.2.4 纯培养菌株荧光原位杂交
2.2.5 探针荧光原位杂交最适条件的优化
2.2.6 验证探针严谨性和覆盖度的实验
2.2.7 慢生单胞菌目qPCR引物的设计与验证
2.3 实验结果
2.3.1 所设计探针及其覆盖度
2.3.2 以探针序列为引物进行高通量测序结果
2.3.3 荧光原位杂交最适条件探究
2.3.4 所设计探针严谨性和覆盖度的纯菌实验
2.3.5 慢生单胞菌目qPCR引物的设计与验证
2.4 本章小结
第三章 文登盐场及运城盐湖沉积物中慢生单胞菌目丰度检测
3.1 实验材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要仪器与设备
3.1.3 实验试剂与耗材
3.1.4 溶液及培养基配置
3.2 实验方法
3.2.1 沉积物样品的固定及样品DNA提取
3.2.2 沉积物样品PCR扩增、16S rRNA基因扩增子测序及分析
3.2.3 荧光定量PCR分析
3.2.4 沉积物样品FISH试验分析
3.3 实验结果
3.3.1 16S rRNA基因扩增子测序慢生单胞菌目的丰度
3.3.2 荧光定量PCR结果
3.3.3 FISH检验结果
3.3.4 慢生单胞菌丰度与环境因子之间的相关性分析
3.4 本章小结与讨论
第四章 文登盐场和运城盐湖细菌群落多样性分析
4.1 实验材料
4.1.1 采样地点及样品信息
4.1.2 主要仪器与设备
4.2 实验方法
4.2.1 样品处理
4.2.2 理化因子的测定
4.2.3 16S rRNA基因扩增子测序及数据处理
4.2.4 分子生态网络构建及分析
4.3 实验结果与讨论
4.3.1 样品的理化因子特征
4.3.2 不同样品中的物种组成及α-多样性分析
4.3.3 样品之间共有OTU分析
4.3.4 理化因子对样品中细菌群落结构的影响
4.3.5 水样及沉积物样品的分子生态网络分析
4.4 本章小结
第五章 两株海洋新菌的多相分类研究
5.1 实验材料
5.1.1 实验所用菌株
5.1.2 主要仪器与设备
5.1.3 实验试剂与耗材
5.1.4 溶液及培养基的配置
5.2 实验方法
5.2.1 16S rRNA基因序列分析
5.2.2 基因组序列分析
5.2.3 系统发育分析
5.2.4 菌株表型和生理生化分析
5.2.5 细菌化学组分测定
5.2.6 菌种保藏
5.3 实验结果与分析
5.3.1 柠檬色淤泥杆菌(Lutibacter citreus)1KV19~T的多相分类
5.3.2 海滨革兰氏菌(Gramella litoralis)KN1008~T的多相分类
5.4 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望与不足
参考文献
致谢
附录
附录一 实验所用主要仪器与设备
附录二 实验所用主要试剂与耗材
附录三 实验所用主要溶液及培养基的配置
附录四 部分实验数据
资助情况
攻读硕士学位期间发表的学位论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3654657
【文章页数】：152 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 绪论
1.1 高盐环境及其中的微生物
1.1.1 高盐环境及其分类
1.1.2 高盐环境中的微生物
1.1.3 国内外对高盐环境微生物的研究
1.2 环境中的微生物群落及其网络分析
1.3 慢生单胞菌目及其研究进展
1.4 环境微生物的检测方法
1.4.1 培养方法检测环境中的微生物
1.4.2 荧光原位杂交技术
1.4.3 高通量测序技术
1.4.4 定量PCR (Quantitative-PCR)
1.5 立题依据
第二章 慢生单胞菌目水平探针及引物的设计
2.1 实验材料
2.1.1 实验样品与菌株
2.1.2 主要仪器与设备
2.1.3 实验试剂与耗材
2.1.4 溶液与培养基配置
2.2 实验方法
2.2.1 慢生单胞菌目特异性探针的设计及合成
2.2.2 以探针序列为引物进行高通量测序验证探针的可靠性
2.2.3 实验所用菌株的培养以及菌体收集
2.2.4 纯培养菌株荧光原位杂交
2.2.5 探针荧光原位杂交最适条件的优化
2.2.6 验证探针严谨性和覆盖度的实验
2.2.7 慢生单胞菌目qPCR引物的设计与验证
2.3 实验结果
2.3.1 所设计探针及其覆盖度
2.3.2 以探针序列为引物进行高通量测序结果
2.3.3 荧光原位杂交最适条件探究
2.3.4 所设计探针严谨性和覆盖度的纯菌实验
2.3.5 慢生单胞菌目qPCR引物的设计与验证
2.4 本章小结
第三章 文登盐场及运城盐湖沉积物中慢生单胞菌目丰度检测
3.1 实验材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要仪器与设备
3.1.3 实验试剂与耗材
3.1.4 溶液及培养基配置
3.2 实验方法
3.2.1 沉积物样品的固定及样品DNA提取
3.2.2 沉积物样品PCR扩增、16S rRNA基因扩增子测序及分析
3.2.3 荧光定量PCR分析
3.2.4 沉积物样品FISH试验分析
3.3 实验结果
3.3.1 16S rRNA基因扩增子测序慢生单胞菌目的丰度
3.3.2 荧光定量PCR结果
3.3.3 FISH检验结果
3.3.4 慢生单胞菌丰度与环境因子之间的相关性分析
3.4 本章小结与讨论
第四章 文登盐场和运城盐湖细菌群落多样性分析
4.1 实验材料
4.1.1 采样地点及样品信息
4.1.2 主要仪器与设备
4.2 实验方法
4.2.1 样品处理
4.2.2 理化因子的测定
4.2.3 16S rRNA基因扩增子测序及数据处理
4.2.4 分子生态网络构建及分析
4.3 实验结果与讨论
4.3.1 样品的理化因子特征
4.3.2 不同样品中的物种组成及α-多样性分析
4.3.3 样品之间共有OTU分析
4.3.4 理化因子对样品中细菌群落结构的影响
4.3.5 水样及沉积物样品的分子生态网络分析
4.4 本章小结
第五章 两株海洋新菌的多相分类研究
5.1 实验材料
5.1.1 实验所用菌株
5.1.2 主要仪器与设备
5.1.3 实验试剂与耗材
5.1.4 溶液及培养基的配置
5.2 实验方法
5.2.1 16S rRNA基因序列分析
5.2.2 基因组序列分析
5.2.3 系统发育分析
5.2.4 菌株表型和生理生化分析
5.2.5 细菌化学组分测定
5.2.6 菌种保藏
5.3 实验结果与分析
5.3.1 柠檬色淤泥杆菌(Lutibacter citreus)1KV19~T的多相分类
5.3.2 海滨革兰氏菌(Gramella litoralis)KN1008~T的多相分类
5.4 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望与不足
参考文献
致谢
附录
附录一 实验所用主要仪器与设备
附录二 实验所用主要试剂与耗材
附录三 实验所用主要溶液及培养基的配置
附录四 部分实验数据
资助情况
攻读硕士学位期间发表的学位论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3654657
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