大白菜BrCYP79B2/B3启动子克隆及特异性分析
发布时间：2022-08-12 16:09
大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）叶用蔬菜。硫代葡萄糖苷（Glucosinolates, GS,简称硫苷）,是一种在十字花科植物中广泛存在的植物次生代谢产物,具有多种不同功能。本实验通过克隆大白菜’chiifu’中的BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3启动子,构建GUS表达载体,转化拟南芥,分析它们的表达水平差异,为研究这些基因在吲哚族硫苷合成途径中的功能分化奠定基础。主要研究结果如下：（1）根据Brassica Database和BrGDB Query确定BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、 BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3启动子的长度与位置,用软件Primer Premier5设计特异引物。（2）克隆BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3启动子。分析这些启动子序列元件,发现它们不仅含有TATA-bo...
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
1.1 大白菜
1.2 硫代葡萄糖苷概况及其功能
1.2.1 硫代葡萄糖苷的化学结构
1.2.2 硫代葡萄糖苷合成的影响因素
1.2.2.1 基因型对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.2 光对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.3 温度对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.4 水分对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.5 硫、氮元素对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.6 盐胁迫对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.7 机械损伤和昆虫取食对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.8 激素对硫代葡萄糖苷的影响
1.3 启动子的特征与结构
1.3.1 启动子特征简介
1.3.2 启动子的结构
1.3.2.1 核心启动元件
1.3.2.2 上游(或下游)启动元件
1.4 启动子分类
1.4.1 组成型启动子
1.4.1.1 来自非植物自身的组成型启动子
1.4.1.2 来自植物自身的启动子
1.4.2 组织特异性启动子
1.4.2.1 果实特异性启动子
1.4.2.2 茎叶特异性启动子
1.4.2.3 根特异性启动子
1.4.3 诱导型启动子
1.4.3.1 光诱导表达启动子
1.4.3.2 热诱导表达启动子
1.4.3.3 创伤诱导表达启动子
1.4.3.4 其他表达启动子
1.5 CKP79基因家族的研究进展
1.6 本研究的目的及意义
2 试验材料与方法
2.1 试验材料
2.2 实验仪器和试剂
2.3 BrCYP79B2/B3启动子克隆及拟南芥转化
2.3.1 大白菜DNA提取
2.3.1.1 DNA提取试剂盒提取大白菜‘chiifu’总DNA
2.3.1.2 DNA凝胶电泳检测
2.3.2 BrCYP79B2/B3启动子的克隆
2.3.2.1 引物设计
2.3.2.2 PCR扩增
2.3.2.3 扩增产物凝胶电泳检测
2.3.3 植物克隆载体的构建
2.3.3.1 PCR产物切胶回收
2.3.3.2 目的片段与载体连接构建
2.3.3.3 连接产物转化大肠杆菌
2.3.3.4 单克隆菌体挑取,培养及PCR检测
2.3.3.5 菌液PCR凝胶电泳检测
2.3.3.6 启动子序列分析
2.3.4 表达载体的构建
2.3.4.1 质粒提取
2.3.4.2 酶切质粒DNA
2.3.4.3 连接并构建表达载体
2.3.4.4 农杆菌感受态细胞制备
2.3.4.5 冻融法转化农杆菌
2.3.4.6 单克隆菌体挑取,培养及PCR检测
2.3.4.7 菌液PCR凝胶电泳检测
2.3.5 转基因植株的获得
2.3.5.1 拟南芥播种及培养
2.3.5.2 花序侵染法转化拟南芥
2.3.5.3 筛选转基因拟南芥
2.4 转基因植株GUS组织化学染色
2.4.1 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子在转基因拟南芥中表达的影响
2.5 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达变化的影响
2.5.1 RNA提取及检测
2.5.1.1 Trizol法提取RNA
2.5.1.2 RNA凝胶电泳检测
2.5.2 去除RNA中基因组DNA并进行反转录成为cDNA
2.5.3 qRT-PCR
3 结果与分析
3.1 大白菜‘chiifu’基因组DNA提取
3.2 BrCYP79B2/B3启动子的克隆
3.3 启动子序列分析
3.4 启动子驱动的GUS基因植物表达载体构建
3.4.1 启动子载体的酶切鉴定
3.4.2 农杆菌中质粒鉴定
3.5 转基因拟南芥的获得
3.6 转基因拟南芥PCR检测
3.7 ProB_(2-1):GUS、ProB_(2-3)：GUS的组织特异性分析
3.7.1 子叶期各启动子的组织表达模式
3.7.2 莲座期期各启动子的组织表达模式
3.7.3 抽薹开花期各启动子的组织表达模式
3.7.4 成熟期各启动子的组织表达模式
3.7.5 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子在转基因拟南芥中表达的影响
3.8 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达的影响
4 讨论
5 结论
5.1 BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3和BrCYP79B3启动子区域分析
5.2 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子的表达模式具有相似性
5.3 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子的表达模式具有各自特异部位
5.4 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达量影响不同
5.5 BrCYP79B2-1和BrCYP7982-3启动子受NaCl、MeJA、Kyn、AOA影响的差异和相似性
参考文献
个人简介
致谢
本文编号：3676186
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
1.1 大白菜
1.2 硫代葡萄糖苷概况及其功能
1.2.1 硫代葡萄糖苷的化学结构
1.2.2 硫代葡萄糖苷合成的影响因素
1.2.2.1 基因型对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.2 光对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.3 温度对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.4 水分对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.5 硫、氮元素对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.6 盐胁迫对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.7 机械损伤和昆虫取食对硫代葡萄糖苷的影响
1.2.2.8 激素对硫代葡萄糖苷的影响
1.3 启动子的特征与结构
1.3.1 启动子特征简介
1.3.2 启动子的结构
1.3.2.1 核心启动元件
1.3.2.2 上游(或下游)启动元件
1.4 启动子分类
1.4.1 组成型启动子
1.4.1.1 来自非植物自身的组成型启动子
1.4.1.2 来自植物自身的启动子
1.4.2 组织特异性启动子
1.4.2.1 果实特异性启动子
1.4.2.2 茎叶特异性启动子
1.4.2.3 根特异性启动子
1.4.3 诱导型启动子
1.4.3.1 光诱导表达启动子
1.4.3.2 热诱导表达启动子
1.4.3.3 创伤诱导表达启动子
1.4.3.4 其他表达启动子
1.5 CKP79基因家族的研究进展
1.6 本研究的目的及意义
2 试验材料与方法
2.1 试验材料
2.2 实验仪器和试剂
2.3 BrCYP79B2/B3启动子克隆及拟南芥转化
2.3.1 大白菜DNA提取
2.3.1.1 DNA提取试剂盒提取大白菜‘chiifu’总DNA
2.3.1.2 DNA凝胶电泳检测
2.3.2 BrCYP79B2/B3启动子的克隆
2.3.2.1 引物设计
2.3.2.2 PCR扩增
2.3.2.3 扩增产物凝胶电泳检测
2.3.3 植物克隆载体的构建
2.3.3.1 PCR产物切胶回收
2.3.3.2 目的片段与载体连接构建
2.3.3.3 连接产物转化大肠杆菌
2.3.3.4 单克隆菌体挑取,培养及PCR检测
2.3.3.5 菌液PCR凝胶电泳检测
2.3.3.6 启动子序列分析
2.3.4 表达载体的构建
2.3.4.1 质粒提取
2.3.4.2 酶切质粒DNA
2.3.4.3 连接并构建表达载体
2.3.4.4 农杆菌感受态细胞制备
2.3.4.5 冻融法转化农杆菌
2.3.4.6 单克隆菌体挑取,培养及PCR检测
2.3.4.7 菌液PCR凝胶电泳检测
2.3.5 转基因植株的获得
2.3.5.1 拟南芥播种及培养
2.3.5.2 花序侵染法转化拟南芥
2.3.5.3 筛选转基因拟南芥
2.4 转基因植株GUS组织化学染色
2.4.1 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子在转基因拟南芥中表达的影响
2.5 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达变化的影响
2.5.1 RNA提取及检测
2.5.1.1 Trizol法提取RNA
2.5.1.2 RNA凝胶电泳检测
2.5.2 去除RNA中基因组DNA并进行反转录成为cDNA
2.5.3 qRT-PCR
3 结果与分析
3.1 大白菜‘chiifu’基因组DNA提取
3.2 BrCYP79B2/B3启动子的克隆
3.3 启动子序列分析
3.4 启动子驱动的GUS基因植物表达载体构建
3.4.1 启动子载体的酶切鉴定
3.4.2 农杆菌中质粒鉴定
3.5 转基因拟南芥的获得
3.6 转基因拟南芥PCR检测
3.7 ProB_(2-1):GUS、ProB_(2-3)：GUS的组织特异性分析
3.7.1 子叶期各启动子的组织表达模式
3.7.2 莲座期期各启动子的组织表达模式
3.7.3 抽薹开花期各启动子的组织表达模式
3.7.4 成熟期各启动子的组织表达模式
3.7.5 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子在转基因拟南芥中表达的影响
3.8 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达的影响
4 讨论
5 结论
5.1 BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3和BrCYP79B3启动子区域分析
5.2 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子的表达模式具有相似性
5.3 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子的表达模式具有各自特异部位
5.4 不同处理对BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3启动子表达量影响不同
5.5 BrCYP79B2-1和BrCYP7982-3启动子受NaCl、MeJA、Kyn、AOA影响的差异和相似性
参考文献
个人简介
致谢
本文编号：3676186
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3676186.html
