阿维链霉菌细胞色素P450单加氧酶AveE功能研究

发布时间：2022-10-21 09:17

　　阿维菌素（Avermectin）是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的一类具有杀虫、杀螨等活性的十六元大环内酯类化合物,其杀虫谱广、药效持久已获得诺贝尔奖承认。阿维菌素的生物合成研究始于20多年前,由于阿维菌素在实际应用中的重要性,其生物合成机制也一直是微生物遗传学及生物化学领域的热点问题。其生物合成途径中存在一种细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 enzymes,CYP450）AveE,被认为参与催化阿维菌素前体后修饰的第一步反应,但AveE的功能仅仅是由体内敲除预测的,其体外酶活有待阐明。细胞色素P450酶是一类含有亚铁血红素催化中心的蛋白超家族,具有分布广泛、功能多样化等特点,被誉为“生物界的万能催化剂”。绝大多数P450都会借助还原伴侣蛋白传递电子完成催化反应。在细菌中,常见的还原伴侣蛋白系统是由包含黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的铁氧还蛋白还原酶（Ferredoxin Reductase,FdR）和由包含铁硫簇的铁氧还蛋白（Ferredoxin,Fdx）组成的Ⅰ类还原伴侣系统,负责将来自于辅因子NAD（P）H的电子沿传递链“N... 

【文章页数】：109 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1细胞色素P450
        1.1.1 细胞色素P450简介
        1.1.2 细胞色素P450的催化机理
    1.2 阿维菌素生物合成研究进展
        1.2.1 阿维菌素的化学结构及其应用
        1.2.2 阿维菌素生物合成相关基因的功能分析
    1.3 基因编辑技术及CRISPR/cas9
        1.3.1 基因编辑技术
        1.3.2 CRISPR/cas9
        1.3.3 CRISPR/cas9 技术在放线菌基因组编辑中的应用
    1.4 本研究的目的及意义
第二章 阿维链霉菌还原伴侣的表达与纯化
    2.1 实验材料及方法
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 引物设计
        2.1.4 基因的克隆与表达质粒的构建
        2.1.5 还原伴侣蛋白的表达与纯化
        2.1.6 大肠杆菌化学感受态的制备与转化
        2.1.7 还原伴侣浓度的测定
    2.2 实验结果与分析
    2.3 本章小结
第三章 单加氧酶AveE的表达及纯化
    3.1 单加氧酶AveE在大肠杆菌中的表达
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 试剂
        3.1.3 引物设计
        3.1.4 基因克隆和表达质粒的构建
        3.1.5 重组蛋白的表达及纯化
        3.1.6 蛋白浓度的测定
    3.2 单加氧酶AveE在链霉菌中的表达
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 试剂
        3.2.3 引物设计
        3.2.4 链霉菌孢子悬液的制备和保存
        3.2.5 链霉菌基因组的提取
        3.2.6 基因克隆和表达质粒的构建
        3.2.7 大肠杆菌化学感受态的制备与转化
        3.2.8 接合转移
        3.2.9 蛋白的表达及纯化
        3.2.10 蛋白浓度的测定
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 载体构建
        3.3.2 链霉菌菌落PCR结果
        3.3.3 单加氧酶AveE的表达及纯化
    3.4 本章小结
第四章 阿维链霉菌aveE及 aveBI-BVIII敲除菌株的构建
    4.1 实验材料及方法
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 试剂
        4.1.3 引物设计
        4.1.4 基因克隆和质粒的构建
        4.1.5 质粒转化大肠杆菌感受态ET12567/pUZ8002
        4.1.6 野生型菌株抗性检测
        4.1.7 接合、筛选及质粒自杀
        4.1.8 菌落PCR筛选转基因链霉菌
        4.1.9 链霉菌的发酵
        4.1.10 发酵产物的分析
    4.2 实验结果与分析
        4.2.1 野生型菌株抗性检测
        4.2.2 CRISPR/cas9质粒构建
        4.2.3 菌落PCR验证
        4.2.4 抗性筛选验证
        4.2.5 阿维链霉菌的发酵
        4.2.6 发酵产物的分析
    4.3 本章小结
第五章 AveE体外酶活验证
    5.1 实验材料及方法
        5.1.1 试剂
        5.1.2 反应体系
    5.2 实验结果与分析
第六章 讨论
结论与展望
参考文献
附录
    附录1 缩略语
    附录2 主要仪器
    附录3 主要试剂
    附录4 培养基和溶液
    附录5 基因序列
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]细胞色素P450酶与微生物药物创制[J]. 李众,张伟,李盛英.  微生物学报. 2016(03)

硕士论文
[1]应用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因的研究[D]. 田茂竹.贵州大学 2019
[2]TEV酶在大肠杆菌中的融合表达及其分析方法研究[D]. 张军辉.华南农业大学 2016



本文编号：3695361