重组PD-1和PD-L1胞外片段及其适体的制备
发布时间：2022-12-06 01:04
研究背景程序性死亡因子受体1（PD-1）是机体重要的免疫检查点,它与配体组成的PD-1/PD-L1通路是免疫细胞衰竭、免疫功能损伤以及慢性病毒感染的重要机制,此外还与自身免疫疾病、移植物免疫排斥、异常基因以及妊娠相关免疫疾病的调控密切相关,这也让靶向PD-1、PD-L1免疫疗法或针对此疗法的伴随检测成为近几年的热点研究。利用SELEX技术筛选的适体通过检测生物标志物对疾病进行诊断、疗效评估或作为PD-1/PD-L1抑制剂干扰、阻断通路,推动PD-1/PD-L1靶标在疾病防治上发挥更大的应用价值。研究目的制备PD-1、PD-L1胞外片段可溶性重组蛋白,将二者作为靶标分别筛选其各自高特异性、高亲和力适体,并对筛选的适体进行鉴定与表征。研究方法（1）采用基因工程技术构建PD-1、PD-L1原核表达工程菌。经发酵、裂解、包涵体处理、凝胶柱脱盐、分离层析获得纯化重组蛋白。利用TricineSDS-PAGE、Western blot、肽质量指纹图谱、BCA测定等对重组蛋白检测分析。（2）合成随机ssDNA适体文库,建立SELEX筛选方案。利用变性PAGE、qPCR、核酸定量、QCM等方法监控筛选和...
【文章页数】：120 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1PD-1和其配体PD-L1
1.2 PD-1、PD-L1的结构基因与信号通路
1.3 PD-1/PD-L1通路的生物免疫学功能
1.3.1 PD-1/PD-L1与肿瘤逃逸
1.3.2 PD-1/PD-L1与慢性病毒感染
1.3.3 PD-1/PD-L1与自身免疫性疾病
1.3.4 PD-1/PD-L1与调节移植物排斥
1.3.5 PD-1/PD-L1与妊娠免疫相关疾病
1.3.6 PD-1/PD-L1与基因异常
1.4 PD-1、PD-L1的医学应用
1.5 适体
1.5.1 适体与SELEX技术
1.5.2 适体的应用与优势
1.5.3 适体筛选方案的建立
1.6 本课题目的和意义
1.6.1 研究目的
1.6.2 课题意义
1.7 技术路线图
1.7.1 课题的整体实验思路
1.7.2 PD-1、PD-L1重组蛋白制备路线图
1.7.3 适体筛选鉴定与表征路线图
第2章 PD-1、PD-L1原核表达载体的构建
2.1 实验材料、试剂与主要仪器
2.1.1 目的基因、表达载体及引物的获取
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要溶液配制
2.2 实验方法与步骤
2.2.1 目的基因与载体的质粒提取
2.2.2 质粒双酶切
2.2.3 琼脂糖核酸电泳
2.2.4 DNA的切胶回收和纯化
2.2.5 制备E.coli DH5α、BL21(DE3)感受态
2.2.6 DNA连接、转化与克隆鉴定
2.2.7 IPTG小剂量诱导表达蛋白
2.2.8 Tricine-SDS-PAGE电泳
2.3 实验结果与分析
2.3.1 DNA质粒的双酶切
2.3.2 E.coli DH5α克隆载体的鉴定
2.3.3 E.coli BL21 表达载体的鉴定
2.3.4 诱导蛋白的可溶性分析
2.4 本章小结与讨论
2.4.1 本章小结
2.4.2 讨论
第3章 包涵体的处理与蛋白纯化、鉴定
3.1 实验材料、试剂与仪器
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 主要溶液配制
3.2 实验方法与步骤
3.2.1 乳糖培养液诱导表达
3.2.2 包涵体的破碎处理
3.2.3 包涵体的洗涤
3.2.4 包涵体溶解
3.2.5 Sephadex G-25 脱盐
3.2.6 蛋白超滤浓缩
3.2.7 Sephacryl S-100 纯化
3.2.8 BCA法测定蛋白浓度
3.2.9 纯化蛋白的鉴定分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 包涵体的处理
3.3.2 G-25凝胶柱层析脱盐
3.3.3 Sephacryl S-100 凝胶柱层析纯化
3.3.4 重组蛋白的纯度鉴定
3.3.5 Western blot鉴定
3.3.6 肽质量指纹图谱
3.4 本章小结与讨论
3.4.1 本章小结
3.4.2 讨论
第4章 PD-1、PD-L1蛋白的适体的筛选
4.1 实验材料、试剂与仪器
4.1.1 随机单链寡核苷酸文库及引物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要溶液配制
4.2 SELEX的初步探索及优化
4.2.1 PCR体系条件的优化
4.2.2 磁珠-蛋白偶联率
4.2.3 磁珠-核酸固定时间
4.3 SELEX筛选方案
4.3.1 氨基磁珠的活化
4.3.2 靶蛋白PD-1、PD-L1的偶联
4.3.3 封闭
4.3.4 结合ssDNA适体文库
4.3.5 洗脱未结合序列
4.3.6 PCR扩增与回收纯化
4.3.7 磁珠分离法垂钓ssDNA次级文库
4.3.8 次级文库的检测
4.4 实验结果与分析
4.4.1 PCR扩增的优化探索
4.4.2 磁珠-蛋白偶联率
4.4.3 磁珠-核酸最佳固定时间
4.4.4 富集适体的扩增产物检测
4.4.5 次级文库的检测分析
4.4.6 实时荧光定量PCR检测
4.4.7 石英晶体微天平(QCM)
4.5 本章小结与讨论
4.5.1 本章小结
4.5.2 讨论
第5章 适体分子的克隆与表征
5.1 实验材料、试剂与仪器
5.2 实验方法
5.2.1 富集适体产物的PCR扩增
5.2.2 适体分子的克隆
5.2.3 阳性克隆的鉴定
5.2.4 斑点印迹杂交实验(Dot bloting)
5.2.5 凝胶阻滞实验(EMSA)
5.3 实验结果与分析
5.3.1 富集适体的PCR扩增
5.3.2 阳性克隆的菌落PCR鉴定
5.3.3 适体的序列分析
5.3.4 Dot blot鉴定
5.3.5 凝胶阻滞验证
5.3.6 Mfold二级结构分析
5.4 本章小结与讨论
5.4.1 本章小结
5.4.2 讨论
第6章 结论
6.1 研究课题的总结
6.2 论文的特色与创新点
6.2.1 选题创新
6.2.2 内容创新
6.2.3 成果创新
6.3 需进一步开展的研究
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑斑侧褶蛙Temporin基因内含子在PCR扩增、克隆和Sanger测序过程中的复制跳跃[J]. 崔杰,林煜,徐艳春,杨淑慧. 野生动物学报. 2018(03)
[2]基于NHS基团修饰的副溶血性弧菌免疫磁珠制备及其富集性能评价[J]. 刘阳,刘文侠,孙力军,施琦,邱妹,邓旗. 安徽农业科学. 2018(06)
[3]PD-1/PD-L1在系统性红斑狼疮患者外周血表达水平及其临床意义[J]. 邵康,张晨星,赵莉,吴标,王颖. 现代免疫学. 2014(05)
[4]富集H5N1亚型禽流感病毒生物磁珠的制备[J]. 张馨元,李志萍,李乾学,夏志平,马红霞. 中国兽医学报. 2014(09)
[5]转基因玉米EPSPS蛋白适体的筛选与结构分析[J]. 江树勋,黄新,邵碧英,陈敏,陈洪俊,陈文炳,吴亚君,潘大仁. 热带作物学报. 2010(04)
[6]一种基于肽质量指纹谱技术鉴定蓖麻毒素的新方法[J]. 闫妍,张淑珍,唐吉军,顾明松,冯建林,谢剑炜. 分析化学. 2006(02)
博士论文
[1]核酸结合蛋白的预测研究[D]. 张晓利.华中科技大学 2017
硕士论文
[1]抗精子适体的制备及其抑精功能的初步研究[D]. 王一杏.华侨大学 2015
[2]EHEC O157:H7和空肠弯曲菌氨基磁珠-LAMP检测方法的建立[D]. 王雪.华中农业大学 2015
[3]基于适体技术体外检测血管内皮生长因子165[D]. 马静.华侨大学 2014
本文编号：3710729
【文章页数】：120 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1PD-1和其配体PD-L1
1.2 PD-1、PD-L1的结构基因与信号通路
1.3 PD-1/PD-L1通路的生物免疫学功能
1.3.1 PD-1/PD-L1与肿瘤逃逸
1.3.2 PD-1/PD-L1与慢性病毒感染
1.3.3 PD-1/PD-L1与自身免疫性疾病
1.3.4 PD-1/PD-L1与调节移植物排斥
1.3.5 PD-1/PD-L1与妊娠免疫相关疾病
1.3.6 PD-1/PD-L1与基因异常
1.4 PD-1、PD-L1的医学应用
1.5 适体
1.5.1 适体与SELEX技术
1.5.2 适体的应用与优势
1.5.3 适体筛选方案的建立
1.6 本课题目的和意义
1.6.1 研究目的
1.6.2 课题意义
1.7 技术路线图
1.7.1 课题的整体实验思路
1.7.2 PD-1、PD-L1重组蛋白制备路线图
1.7.3 适体筛选鉴定与表征路线图
第2章 PD-1、PD-L1原核表达载体的构建
2.1 实验材料、试剂与主要仪器
2.1.1 目的基因、表达载体及引物的获取
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要溶液配制
2.2 实验方法与步骤
2.2.1 目的基因与载体的质粒提取
2.2.2 质粒双酶切
2.2.3 琼脂糖核酸电泳
2.2.4 DNA的切胶回收和纯化
2.2.5 制备E.coli DH5α、BL21(DE3)感受态
2.2.6 DNA连接、转化与克隆鉴定
2.2.7 IPTG小剂量诱导表达蛋白
2.2.8 Tricine-SDS-PAGE电泳
2.3 实验结果与分析
2.3.1 DNA质粒的双酶切
2.3.2 E.coli DH5α克隆载体的鉴定
2.3.3 E.coli BL21 表达载体的鉴定
2.3.4 诱导蛋白的可溶性分析
2.4 本章小结与讨论
2.4.1 本章小结
2.4.2 讨论
第3章 包涵体的处理与蛋白纯化、鉴定
3.1 实验材料、试剂与仪器
3.1.1 主要试剂
3.1.2 主要仪器
3.1.3 主要溶液配制
3.2 实验方法与步骤
3.2.1 乳糖培养液诱导表达
3.2.2 包涵体的破碎处理
3.2.3 包涵体的洗涤
3.2.4 包涵体溶解
3.2.5 Sephadex G-25 脱盐
3.2.6 蛋白超滤浓缩
3.2.7 Sephacryl S-100 纯化
3.2.8 BCA法测定蛋白浓度
3.2.9 纯化蛋白的鉴定分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 包涵体的处理
3.3.2 G-25凝胶柱层析脱盐
3.3.3 Sephacryl S-100 凝胶柱层析纯化
3.3.4 重组蛋白的纯度鉴定
3.3.5 Western blot鉴定
3.3.6 肽质量指纹图谱
3.4 本章小结与讨论
3.4.1 本章小结
3.4.2 讨论
第4章 PD-1、PD-L1蛋白的适体的筛选
4.1 实验材料、试剂与仪器
4.1.1 随机单链寡核苷酸文库及引物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要溶液配制
4.2 SELEX的初步探索及优化
4.2.1 PCR体系条件的优化
4.2.2 磁珠-蛋白偶联率
4.2.3 磁珠-核酸固定时间
4.3 SELEX筛选方案
4.3.1 氨基磁珠的活化
4.3.2 靶蛋白PD-1、PD-L1的偶联
4.3.3 封闭
4.3.4 结合ssDNA适体文库
4.3.5 洗脱未结合序列
4.3.6 PCR扩增与回收纯化
4.3.7 磁珠分离法垂钓ssDNA次级文库
4.3.8 次级文库的检测
4.4 实验结果与分析
4.4.1 PCR扩增的优化探索
4.4.2 磁珠-蛋白偶联率
4.4.3 磁珠-核酸最佳固定时间
4.4.4 富集适体的扩增产物检测
4.4.5 次级文库的检测分析
4.4.6 实时荧光定量PCR检测
4.4.7 石英晶体微天平(QCM)
4.5 本章小结与讨论
4.5.1 本章小结
4.5.2 讨论
第5章 适体分子的克隆与表征
5.1 实验材料、试剂与仪器
5.2 实验方法
5.2.1 富集适体产物的PCR扩增
5.2.2 适体分子的克隆
5.2.3 阳性克隆的鉴定
5.2.4 斑点印迹杂交实验(Dot bloting)
5.2.5 凝胶阻滞实验(EMSA)
5.3 实验结果与分析
5.3.1 富集适体的PCR扩增
5.3.2 阳性克隆的菌落PCR鉴定
5.3.3 适体的序列分析
5.3.4 Dot blot鉴定
5.3.5 凝胶阻滞验证
5.3.6 Mfold二级结构分析
5.4 本章小结与讨论
5.4.1 本章小结
5.4.2 讨论
第6章 结论
6.1 研究课题的总结
6.2 论文的特色与创新点
6.2.1 选题创新
6.2.2 内容创新
6.2.3 成果创新
6.3 需进一步开展的研究
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]黑斑侧褶蛙Temporin基因内含子在PCR扩增、克隆和Sanger测序过程中的复制跳跃[J]. 崔杰,林煜,徐艳春,杨淑慧. 野生动物学报. 2018(03)
[2]基于NHS基团修饰的副溶血性弧菌免疫磁珠制备及其富集性能评价[J]. 刘阳,刘文侠,孙力军,施琦,邱妹,邓旗. 安徽农业科学. 2018(06)
[3]PD-1/PD-L1在系统性红斑狼疮患者外周血表达水平及其临床意义[J]. 邵康,张晨星,赵莉,吴标,王颖. 现代免疫学. 2014(05)
[4]富集H5N1亚型禽流感病毒生物磁珠的制备[J]. 张馨元,李志萍,李乾学,夏志平,马红霞. 中国兽医学报. 2014(09)
[5]转基因玉米EPSPS蛋白适体的筛选与结构分析[J]. 江树勋,黄新,邵碧英,陈敏,陈洪俊,陈文炳,吴亚君,潘大仁. 热带作物学报. 2010(04)
[6]一种基于肽质量指纹谱技术鉴定蓖麻毒素的新方法[J]. 闫妍,张淑珍,唐吉军,顾明松,冯建林,谢剑炜. 分析化学. 2006(02)
博士论文
[1]核酸结合蛋白的预测研究[D]. 张晓利.华中科技大学 2017
硕士论文
[1]抗精子适体的制备及其抑精功能的初步研究[D]. 王一杏.华侨大学 2015
[2]EHEC O157:H7和空肠弯曲菌氨基磁珠-LAMP检测方法的建立[D]. 王雪.华中农业大学 2015
[3]基于适体技术体外检测血管内皮生长因子165[D]. 马静.华侨大学 2014
本文编号：3710729
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