A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及血清学检测方法的建立
发布时间：2023-02-23 17:47
A型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的水疱,严重者造成溃烂和跛行。7日龄以内的仔猪死亡率高达70%,偶尔伴有腹泻症状。2014-2015年SVA给巴西养猪业造成严重经济损失,同年SVA首次出现在我国广东地区,属于新型外来病。常用检测方法有病毒的分离鉴定、常规RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒中和试验、利用表达SVA蛋白构建ELISA等。SVA只有一个阅读框,VP1、VP2和VP3构成该病毒的衣壳蛋白。研究表明,以VP2蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法其特异性和灵敏度优于包被抗原为VP1蛋白或VP3蛋白。本试验利用构建的SVA-VP2蛋白作为抗原,建立SVA血清抗体间接ELISA和均相光激化学发光免疫技术(AlphaLISA)检测方法,为SVA-VP2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清学检测试剂盒和基因工程疫苗研究奠定基础。本试验根据SVA分离株GD01/2017中的VP2基因,...
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写对照
1 引言
1.1 A型塞内卡病毒概述
1.1.1 A型塞内卡病毒国内外的研究
1.1.2 A型塞内卡病毒的传播途径和传染源
1.1.3 A型塞内卡病毒病的预防措施
1.1.4 A型塞内卡病毒的检测方法
1.2 AlphaLISA检测技术的研究进展
1.2.1 均相光激化学发光免疫分析技术原理
1.2.2 均相光激化学发光免疫分析技术特点
1.2.3 均相光激化学发光免疫分析技术在生物医学领域的研究
1.2.4 均相光激化学发光免疫分析技术在食品安全领域的研究
1.2.5 均相光激化学发光免疫分析技术在蛋白分子相互作用领域的研究
1.2.6 均相光激化学发光免疫分析在疫病检测领域的研究
1.3 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 试验仪器
2.2 试验材料与试剂
2.2.1 细胞与病毒
2.2.2 载体、菌株与血清样品
2.2.3 试验试剂与试剂盒
2.3 主要试剂配制
2.3.1 LB培养基制备
2.3.2 细胞培养所需试剂的配制
2.3.3 蛋白表达及纯化所需试剂配制
2.3.4 Western blotting所需试剂配制
2.3.5 AlphaLISA检测方法所用试剂配制
2.4 A型塞内卡病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
2.4.1 A型塞内卡病毒VP2基因重组质粒的构建
2.4.2 原核表达载体的构建及VP2蛋白的诱导和纯化
2.5 A型塞内卡病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立
2.5.1 间接ELISA方法的操作流程
2.5.2 间接ELISA方法条件的优化
2.6 A型塞内卡病毒AlphaLISA检测方法建立
2.6.1 抗原的生物素化
2.6.2 抗体与受体微珠偶联
2.6.3 AlphLISA方法试验步骤
2.6.4 AlphaLISA方法的建立
3 结果
3.1 A型塞内卡病毒VP2基因重组质粒的构建结果
3.1.1 A型塞内卡病毒VP2片段的扩增结果
3.1.2 重组质粒的鉴定结果
3.2 原核表达载体的构建及VP2蛋白的诱导和纯化结果
3.2.1 蛋白的表达结果
3.2.2 蛋白表达的优化结果
3.2.3 蛋白质可溶性分析
3.2.4 蛋白纯化
3.2.5 Western-blot鉴定
3.2.6 蛋白浓度测定
3.3 A型塞内卡病毒抗体间接ELISA检测方法的建立结果
3.3.1 间接ELISA方法包被抗原和血清最佳反应条件的确定
3.3.2 辣根过氧化物酶标记(HRP)的抗猪IgG反应的最佳稀释浓度
3.3.3 酶标二抗最佳反应时间的确定
3.3.4 间接ELISA最佳显色时间的确定
3.3.5 间接ELISA临界值的确定
3.3.6 特异性试验
3.3.7 灵敏性试验
3.3.8 重复性试验
3.3.9 临床样品的检测
3.4 A型塞内卡病毒AlphaLISA检测方法结果
3.4.1 抗原和抗体最佳反应浓度
3.4.2 灵敏度的检测
3.4.3 特异性试验
3.4.4 重复性试验
4 讨论
4.1 猪A型塞内卡病毒及其危害
4.2 A型塞内卡病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
4.3 A型塞内卡病毒的检测
5 结论
参考文献
在读期间发表的论文
作者简历
致谢
附件
本文编号：3748456
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
英文缩写对照
1 引言
1.1 A型塞内卡病毒概述
1.1.1 A型塞内卡病毒国内外的研究
1.1.2 A型塞内卡病毒的传播途径和传染源
1.1.3 A型塞内卡病毒病的预防措施
1.1.4 A型塞内卡病毒的检测方法
1.2 AlphaLISA检测技术的研究进展
1.2.1 均相光激化学发光免疫分析技术原理
1.2.2 均相光激化学发光免疫分析技术特点
1.2.3 均相光激化学发光免疫分析技术在生物医学领域的研究
1.2.4 均相光激化学发光免疫分析技术在食品安全领域的研究
1.2.5 均相光激化学发光免疫分析技术在蛋白分子相互作用领域的研究
1.2.6 均相光激化学发光免疫分析在疫病检测领域的研究
1.3 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 试验仪器
2.2 试验材料与试剂
2.2.1 细胞与病毒
2.2.2 载体、菌株与血清样品
2.2.3 试验试剂与试剂盒
2.3 主要试剂配制
2.3.1 LB培养基制备
2.3.2 细胞培养所需试剂的配制
2.3.3 蛋白表达及纯化所需试剂配制
2.3.4 Western blotting所需试剂配制
2.3.5 AlphaLISA检测方法所用试剂配制
2.4 A型塞内卡病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
2.4.1 A型塞内卡病毒VP2基因重组质粒的构建
2.4.2 原核表达载体的构建及VP2蛋白的诱导和纯化
2.5 A型塞内卡病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立
2.5.1 间接ELISA方法的操作流程
2.5.2 间接ELISA方法条件的优化
2.6 A型塞内卡病毒AlphaLISA检测方法建立
2.6.1 抗原的生物素化
2.6.2 抗体与受体微珠偶联
2.6.3 AlphLISA方法试验步骤
2.6.4 AlphaLISA方法的建立
3 结果
3.1 A型塞内卡病毒VP2基因重组质粒的构建结果
3.1.1 A型塞内卡病毒VP2片段的扩增结果
3.1.2 重组质粒的鉴定结果
3.2 原核表达载体的构建及VP2蛋白的诱导和纯化结果
3.2.1 蛋白的表达结果
3.2.2 蛋白表达的优化结果
3.2.3 蛋白质可溶性分析
3.2.4 蛋白纯化
3.2.5 Western-blot鉴定
3.2.6 蛋白浓度测定
3.3 A型塞内卡病毒抗体间接ELISA检测方法的建立结果
3.3.1 间接ELISA方法包被抗原和血清最佳反应条件的确定
3.3.2 辣根过氧化物酶标记(HRP)的抗猪IgG反应的最佳稀释浓度
3.3.3 酶标二抗最佳反应时间的确定
3.3.4 间接ELISA最佳显色时间的确定
3.3.5 间接ELISA临界值的确定
3.3.6 特异性试验
3.3.7 灵敏性试验
3.3.8 重复性试验
3.3.9 临床样品的检测
3.4 A型塞内卡病毒AlphaLISA检测方法结果
3.4.1 抗原和抗体最佳反应浓度
3.4.2 灵敏度的检测
3.4.3 特异性试验
3.4.4 重复性试验
4 讨论
4.1 猪A型塞内卡病毒及其危害
4.2 A型塞内卡病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
4.3 A型塞内卡病毒的检测
5 结论
参考文献
在读期间发表的论文
作者简历
致谢
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